提高重组酵母质粒稳定性和蛋白质产率的培养策略研究

【摘要】： 本文以产α—淀粉酶的基因工程酵母菌S.cerevisiae 20B-12(pNA3)为模型体系，在摇瓶培养条件下对外源基因的表达和发酵进行了初步研究，并在2L发酵罐中对发酵工程条件影响质粒稳定性进行了深入的研究，然后对重组酵母发酵动力学进行了数学模拟。 通过继代摇瓶实验发现，在选择性压力下，重组酵母的质粒稳定性在整个培养过程中保持90％以上。当解除选择性压力后，重组酵母的质粒很快出现缺失，但刚开始比率很低，随后质粒的缺失速度加快。重组酵母培养130小时后，质粒几乎100％的缺失。同时我们比较了平板点种法和平板稀释法测定质粒稳定性的方法，两者结果基本一致。 在摇瓶培养中通过均匀实验对培养条件优化，得出在摇瓶中的较佳培养条件：葡萄糖的浓度是34.8g／L，酵母基础氮的浓度是6.6g／L，初始pH是5.8，诱导产酶酵母膏加入时间是当葡萄糖浓度小于0.299g／L。 接着在2L发酵罐中分别考察在诱导阶段温度、溶氧和pH变化对重组酵母S.cerevisiae 20B-12(pNA3)产α-淀粉酶的影响。同时在2L发酵罐中对发酵条件影响质粒稳定性进行了深入的研究，在对表达外源α-淀粉酶的重组酿酒酵母菌株S.cerevisiae 20B-12(pNA3)的培养中发现了营养缺乏的生长静止期质粒稳定性提高的规律。将此应用于诱导分泌表达外源蛋白质的无选择性压力培养阶段，证明脉冲添加酵母膏对稳定质粒同时诱导SUC2启动子控制的外源基因表达是有效的。 结合菌体增殖、质粒稳定及诱导表达的需要，提出了恒流量流加营养 物，同时脉冲补加酵母膏的营养物脉冲高密度培养方案，实现了外源蛋白 质的效率化生产，最大菌体密度、最大 a－淀粉酶活力分别达到 3 6．4 g／L和 207石 U／mL，培养过程质粒保持率稳定于 90％以上。 最后在上述研究的基础上初步建立了重组酵母发酵的动力学模型，并 对模型参数进行估计。 由于糖分解酶启动子、营养缺陷型选择性压力在重组酿酒酵母菌株构 建中广泛采用，本文提出的培养方案对该类基因工程菌株高密度培养生产 外源蛋白质有借鉴意义。