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《西北大学》 2001年
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高梁CMS相关DNA片段的序列分析及A/B核DNA上的差异研究

范昌发  
【摘要】: 植物细胞质雄性不育(CMS)是指不遵守孟德尔法则而表现为母性遗传的植物雄性不育类型。CMS在育性上表现为小孢子或花粉败育而大孢子发育正常,但某些核基因能够“校正”小孢子的败育,因此CMS是核质互作的结果。在遗传理论上,CMS是研究高等植物核基因调控胞质基因的理想体系;在生产上,CMS可被用于杂种生产而具有巨大的经济价值。 长期的分子生物学研究已获得许多有意义的结果,从不同植物的mtDNA、cpDNA中,已经分离到了大量的认为与CMS发生有关的DNA片段,基因或者ORF。在玉米等多种植物中,对CMS相关基因的转录、翻译等也有详细的研究,依据研究结果提出的假说甚至可以很好的解释某些作物的CMS的发生。但这些结果在解释不育机制时大多不具普适性,往往只能解释某种特定作物、甚至特定类型CMS的发生,其部分原因可能是研究者所选实验材料过于单一或材料间缺乏相关性。 在具不同的细胞核背景或细胞质类型的CMS植物中,寻找共同的、规律性出现的与CMS相关的基因或DNA片段,应更具有普适性的意义。因此我们选用了10个高粱CMS材料,函盖了目前在高粱中发现的主要的A_1、A_2、A_3、A_4、A_5、A_6、9E等7种不育胞质类型,以及4种细胞核保持系、3个恢复系和2个杂种。这19个材料中,不同的CMS系之间,CMS系与相应的保持系之间,为同质异核、同核异质或异质异核关系。从不同的角度分析,可获取关于不同类型的胞质或核基因组的结构信息。而且,这些材料中的A_1、A_2、A_3胞质系统的CMS材料间具有复杂的恢保关系。 为了获得稳定的具代表性的与CMS相关的DNA片段,基于上述较系统而全面的材料,首先采用RAPD技术,选用了近200个10 mer的随机引物扩增A_1Tx623A/B(196个引物),A_2V_4A/B的总DNA(184个引物),经多次重复,获得5个总能在两对材料中扩增出共同的与可育或不育胞质连锁的DNA片段的引物。为检验这5个与两种可育或不育胞质连锁的DNA片段是否在更多种可育或不育胞质连锁,将5个筛选出的引物扩增15个相关的CMS材料,发现有3 个 DNA片段很有规律:片段 SAP06950出现在所有的不育系和杂种 FI中,即与 不育胞质连锁;与之相反,片段 SAAU刀27()0和 SAY*。出现在所有的保持系 和恢复系中,即与可育胞质连锁。 鉴厂3个片段与*Ms的相关性,采用木实验总结出的方法回收后,并进行 .州斑测序羽*予列分析;同卜卜 采用队卜扩增、加吐忧rn杂交等方法,对这些片 段究竟是位r细胞核还是细胞质作了分析,结果如下: 1.片段SA刀6”,为不育胞质mtDNA特有的一新的不完整基因,与核DNA 存在同源性,并可能反映了A/B核DNA上存在差异。 序列分析表明,该片段全长967hp;在GenBank中无同源序列,是一个新的 *NAX段;经**Ns**N预测发现,该片段含有起始、中间两个外显子,编码 223个氨基酸,含有一不完整的开放读码框(ORF)。blastx搜索亦未发现同源的 氨基酸序列,表明该片段编码一个新的氨基酸。以总DNA,mtDNA及cPDNA 为模板的**R扩增,以及 h;;山ern杂交结果均表明该片段来自不育胞质的 mtDNA。比较分析总 DNA和 mtDNA的杂交图谱后认为,该片段也存在于核DNA l-k。该片段与总DNA的杂交结果表明不育系与保持系核DNA上可能存在差异。 这些特性与CMS发生的关系是值得关注的。 2,片段SAAUo2m。CMS系叶绿体NAD(n脱氢酶第4亚基的基因存在 序列变异。 该片段实际测得28比p,为高粱叩ONA的n灿和呷C基因的部分序列, 也是首次测得的高粱 cpDNA的 dhj和 psaC基因的部分序列。PCR检测和 Southern杂交也证实片段 SAAU刀2扣。为 cpDNA起源。该片段与 EcoR+Hnd Ill 双酶切的总 DNA、CpDNA杂交,以及 IlaC Ill酶切的 AITX623/TX623的总 DNA 杂交结果,结合构建的对应于n dhdhD和尸一C基因区的酶切图谱分析,发现*M S 系nD基因内的一个月bIHI位点发生了结构变异。 3.片段 SAYJ 9u。发现 CM S系与保持系的光系统 lpsaAI;尸。IA 2基因区 存在结构变异n 该片段实际全长为2447…为高粱【1-IW绿体尸s1AI,尸s1AZ基因的部分序列。 我们测得的pndl基因在 581位缺失一碱基 A,缺失产生的原因和对脱辅基蛋白 功能是否有影响待进一步研究I*R检测和s加山ern杂交也表明该片段为叩**A 起源,Southern杂交显示不育系和可育系[II绿体基因组存在差异。 片段 SAAU刀2700和 SAY刁 川0同源的基因均与光合作用密切相关,我们认 为可能从两个方面对高粱CMS的发生产生影响:一是损害线粒体的能量代谢, -二是阻碍非储存性淀粉粒在小泡子母细胞内的积累,使之缺乏用于构建必需新物 质的炭架等原料。 发现CMS系与保持系在核DNA上可能存在差异 以AITx623、hV4及T-c623 Vll 和 V4的总 DNA为模板,从近 200个 10 iner随机引物中分别筛选到 15和 6个引 物,其*AP D扩增产物在Aj B间存在稳定差异。用它们分别扩增A/ B的总**A、 XtDNA及CpDNA。以AITX623/TX623总DNA为模板时得到的23个差异片段 中,有 17个在以胞质
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