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《西北大学》 2001年
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重组人γ-干扰素生产工艺优化及α-糜蛋白酶复性研究

申烨华  
【摘要】: 全文包括两部分。第一部分系统研究了重组人γ—干扰素(rhIFN-γ)的高密度发酵及放大工艺,其产量达7.13g/L,为国际报道的9倍。第二部分在色谱柱上研究难复性的蛋白之—α-糜蛋白酶(α-Chy)的复性条件的基础上,研究了rhIFN-γ的复性与同时纯化条件。一步色谱分离与纯化,使rhIFN-γ的纯度95%,最高比活1.8×10~8IU/mg,为国家药物标准的11倍。 第一部分重组人γ-干扰素高密度发酵及放大研究 1.重组大肠杆菌DH5α/pBV220发酵培养基的研究 在摇瓶中对工程菌DH5α/pBV220的发酵培养基进行了研究,确定出M_9培养基为基本培养基。利用单因子实验对M_9培养基中的碳源和氮源进行筛选,确定出最优培养基配方M_9Ⅱ。此时,rhIFN—γ的产量为0.65g/L。 2.重组大肠杆菌DH5α/pBV220摇瓶发酵的研究 通过对工程菌DH5α/pBV220摇瓶发酵中种子菌龄、接种量和诱导时机等工艺条件的研究,确定出摇瓶发酵的最优培养条件。此时,rhIFN-γ的产量为0.72g/L。对培养基中营养成份和pH的分析表明,M_9Ⅱ培养基中的碳源和氮源较丰富,而溶解氧的不足和pH值偏酸性可能是整个培养过程的限制性因素。 3.重组大肠杆菌DH5α/pBV220在5L发酵罐上的间歇培养 在5L发酵罐中,对工程菌DH5α/pBV220间歇培养时的搅拌速度、通气量和表达时间等工芝条件进行了研究,确定出5L发酵罐间歇培养的最优培养条件。实验结果表明,M_9Ⅱ培养基中的碳源和氮源都是充足的,而溶氧的不足和培养基pH偏酸性可能是整个生产过程中的限制性因素。首次提出,除应以工程菌菌体收获量和目标蛋白表达量为标准外,还应以目标蛋白分离纯化为标准,对不同的发酵条件进行筛选。结果表明,工程菌生长和目标蛋白表达的最佳工艺条件与 目标蛋白分离纯化的最仆卜艺条川、川J1川。u,有叫个【。U。 4.重组大肠杆菌 DHS a /pBV220在 SL发酵罐上的高密度流加培养 在SL发酵罐中,通过筛选培养基、溶氧水平、诱导时机和碳源种类等条件, 确定出工程菌 DHS u /pBV220分批流加的优化工艺条件,使 rhlFN-Y的产量达 7.13g几,与己查阅的文献相比,达到国际水平的 9l倍。对分批流加培养时深层 发酵的过程参数进行分析表明,MJV培养基中的碳源、氮源和溶氧都是充足的, 培养基叫>7刀,消除了整个+产过W中的限制忖w素。闩次建立了一申1。筛选培 养基配方的新的试验设计方法。泊方法只而进订一轮。‘n.囚了实验,即可采用逐少 口归技术建立优化数学模型,再利用计算机对松囚于实验数据进行分析,筛选出 主要因子影响,确定出最佳培养基配方。该试验设计方法实验次数少,可避抡筛 选工作中的局部优化问题,并可为分批流加发酵提供流加依据。 5.DHS a巾BV220在 50L发酵罐上的放大研究 选用合适的放大原则,将SL发酵罐的间歇培养和分批流加培养的工艺条件, 成功地放大到50L发酵罐中。在50L发酵罐问歇培养时,rhIFN-Y的产量为2.33 g/L。在 50L分批流加培养时,菌体密度为 OD60029.93,细胞干重为 14 *g/L,*IFN- g的产量为 7刀旮/L,与已查阅的文献相比,达到国际水平的 9刀倍。 第二部分a-糜蛋白酶及重组人v-干扰素复性研究 二.腑变a.糜蛋白酶的液相色谱复性 首次提出将疏水填料加入变性剂中,防止蛋白在变性过程中聚集的方法。设 计出实现这一方法的进样装置。比较了三种不同的疏水填料,使a-Chy的活性回 收率山36.1%提高到59刀%。首次肾1_1该川去的机理。结果表明,疏水填料除具 有类似于分于伴侣的作川,防止变性蛋白聚集,为变性蛋白的复性提供帮助外, 构成疏水填料的配基物质的结构对蛋白复性效率的提高也有帮助。发现变性剂中 加入某些物质既可防止变性蛋白的聚集,还可提高复性效率,并与加入物质的浓 度有关。此外还发现,当变性剂中加入的疏水填料与色谱柱中装填的疏水填料相 同时,a(hy的活性回收率提高最多。 2.重组人Y干扰素的复性与同时纯化 二 在优化出的疏水色谱条件下,rhIFN-Y的 7刀mol/L GuHCI提取液,只经过一 步疏水色谱纯化,rhIFN-Y的纯度可达 96.6%,rhIFN-Y的总比活可达 1.8 X 108IU/mg。只经过1次疏水色谱,用30min就可使活性回收率达到1207%。与己 报道的文献相比,是国内生产水平的4.3倍,与国家药物生产要求的1石X10’ IU/mg相比,是其 11.3倍。
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:TQ920

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【引证文献】
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【参考文献】
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3 史广泉;添加剂与流加操作辅助变性溶菌酶复性动力学[D];天津大学;2004年
4 司马健;(一)hsTRAIL基因的克隆表达、载体选择及蛋白复性研究 (二)谷胱甘肽S-转移酶(GSTp)半胱氨酸的定点突变及其在293细胞中的功能研究[D];南京师范大学;2004年
5 张培源;单链抗体ScFv2F3的表达纯化及复性研究[D];吉林大学;2006年
6 程晓玲;人工分子伴侣体系辅助溶菌酶复性的研究[D];浙江大学;2005年
7 邵玲莉;重组大肠杆菌发酵产血管抑素的研究[D];江南大学;2004年
8 曾艳霞;人胎盘碱性磷酸酶变性与复性的研究[D];青岛大学;2004年
9 罗惠霞;新型rPA(K)原核载体的构建及其表达研究[D];宁夏大学;2005年
10 王会玲;膜Ⅰ型基质金属蛋白酶的表达及其亲和小肽的筛选[D];吉林大学;2006年
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