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《西北大学》 2002年
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新型细胞Ca~(2+)荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用

张小玲  
【摘要】: 细胞内游离Ca~(2+)作为细胞重要的生理应答反应信使,具有重要的生物学功能。因此,细胞游离钙含量及其动态分布变化的测定已成为化学、生物学和基础及临床医学研究中的一个非常重要的研究领域,亦是现代分析化学重要的前沿研究热点。目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的Quin-2、Indo-1、Fura-2及Fluo-3等钙荧光探针而建立的钙荧光指示剂法。然而,该类荧光探针或需要在紫外区激发,导致细胞自身荧光干扰及光损伤;或与Ca~(2+)结合后无荧光峰的位移,难以采用双波长比率法进行测定;或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。迄今为止,尚未见既可长波激发、又与Ca~(2+)结合后荧光峰位移、且对胞内Ca~(2+)测定具特异性、可在亚细胞水平进行Ca~(2+)测定的整体性能优良的钙荧光探针及其在生命科学中的应用研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面:1.首次研究设计并成功合成了国内外文献迄今未见报道的两种新型钙荧光探针(简称STDIn和STDBT,已申请国家发明专利),系统研究了所合成钙荧光探针的结构、光谱特性及细胞荧光标记特性。2.以所合成STDIn—AM为细胞钙荧光探针,采用共聚焦技术,研究了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞胞内游离钙动员的机制,并与Fluo-3进行比较。表明所合成试剂STDIn—AM是目前国内外唯一的可以AM酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性Ca~(2+)荧光探针。3.首次发现了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞产生的钙火花现象,探讨了其形成机制。4.采用了四种不同的活性氧产生体系,对自行合成Ca~(2+)荧光探针STDIn的耐氧化能力进行了考察。并进而以H_2O_2为外源性活性氧,STDIn-AM为探针标记HL—60细胞,激光共聚焦技术探讨了不同浓度H_2O_2对胞内Ca~(2+)的影响,从膜结构和生物信号转导的角度研究了氧自由基对培养细胞的生物学效应。5.采用量子化学方法对新荧光试剂及其Ca~(2+)络合物进行了研究,首次从理论上确定了新荧光试剂及其络合物的几何构型、金属离子在试剂分子中的络合位置,并研究了试剂结构参数与性能之间的关系。 本文靶向性细胞Ca~(2+)荧光探针的设计合成及其在生命科学研究中的应用研究,使细胞钙的测定由单细胞水平拓展到了亚细胞水平,为更深入的细胞信号转导研究提供了可行、有效的手段。这一研究结果,对于新型细胞探针试剂的设计合成,揭示生命科学中的重要生理应答反应信使—胞内游离Ca~(2+)的作用机制具有十分重要的理论意 1穿北大学准味d匕学位创含文2002 义和应用参考价值。 本研究论文包括以下四个部分: 一细胞c扩+测定方法研究进展(综述) 对目前常用的几种细胞C扩+测定方法,特别是钙荧光指示剂法中细胞钙荧光探针 的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述,引用截至2002年的文献103篇。在 此基础上提出了自己拟进行的研究方向。 二.新型细胞c扩+荧光探针的合成及性能研究 1.新型钙荧光探针的合成 设计合成了两种新型钙荧光探针一STDhi和STDBT(其中STDIn已制成相应AM 酉旨型可导入细胞)。 2.新型钙荧光探针的性能研究 研究了试剂的结构、吸收及荧光光谱特性和细胞荧光标记特性。结果表明,所合 成试剂既具备双波长钙荧光探针F盯a一2与c扩+结合前后吸收和荧光峰位移,又保持了 长波长钙荧光探针Fluo一3荧光激发波长位于可见光区的特性。同时细胞荧光图像分析 显示,sTDhi一AM进入细胞后只标记胞浆c扩+而不标记胞核c扩+,是目前唯一的可 以 AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性C扩+荧光探针。并且 其水溶性好,在胞浆内较Fhi小3等更易于负载。试剂整体性能优于目前国内外广泛采 用的C扩+荧光探针。 三.新型c扩+荧光探针在生命科学研究中的应用 1.胞浆特异性c扩+荧光探针sTDhi用于5一轻色胺诱导培养胃底平滑肌细胞内游 离钙动员机制的共聚焦研究 首次采用激光共聚焦技术分别进行了新型Ca=+荧光探针STDIn与Flu。一3对胃底平 滑肌细胞的标记,及其对胞内游离CaZ+浓度变化的响应等特性的比较研究。结果表明, 与Fluo一3不同,新型Ca2+荧光探针STDIn对胞浆Caz+具有靶向性,只标记胞浆而不进 入胞核,是一种真正的胞浆Ca2+荧光探针,对5一轻色胺(5一HT)诱导的胞内游离Caz+ 浓度变化的响应更灵敏迅速。应用于5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内游离Ca2+动员的机 制研究,发现5一HT通过促进外钙内流和内钙释放使[Caz+〕j升高;在胃底平滑肌5一HT 升高〔Ca,‘〕,系通过5一HTZ受体介导的1 P3/Ca,‘和DG/PKC双信使途径;5一HT通过L型钙 通道促进外钙内流。 2.5一HT诱导胃底平滑肌细胞钙火花的研究 以合成的胞浆特异性Caz+荧光探针STDhi一AM标记细胞,采用激光共聚焦线扫 描技术,首次观察到5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内钙释放的最基本单位 一一J塑必尝华盆翔望尝‘一盈些沁 (elementary events),“钙火花(ealeium sparks)”现象。提出其成因于 肌质网上的单个和若干钙释放通道(亦称ryanodine受体)的开启的机理。 3.钙荧光探针STDIn对活性氧的耐受性和在HZO:对HL一60细
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q2-3

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