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《西北大学》 2005年 博士论文
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三种经济植物遗传多样性的ISSR和RAPD分析、fad基因克隆和农杆菌介导的遗传转化

周延清  
【摘要】:本文旨在:Ⅰ.建立河南三种主栽经济植物地黄、山药和大豆种质遗传多样性的ISSR和RAPD标记分析体系,为利用DNA分子标记技术合理利用、保护、鉴定和改良这三种植物品种提供理论和技术依据。Ⅱ.建立发根农杆菌对怀地黄的转化及毛状根的植株再生体系。Ⅲ.分离克隆大豆油酰基-△12-去饱和酶基因fad 2-1和构建反义基因表达载体,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育大豆和怀地黄新品种提供理论和技术依据。 Ⅰ.利用ISSR和RAPD标记技术对这三种经济植物种质遗传多样性进行了检测。其中,ISSR标记技术首次用于这一研究。所取得的主要进展如下:(1).用CTAB法提取了10个地黄品种、28个山药品种和10个大豆品种以及16个怀地黄单株的基因组DNA,建立了适用于山药基因组DNA提取的改良CTAB方法。(2).以怀地黄基因组DNA为模板,优化出了适宜于地黄ISSR分析的合适的退火温度(53-55℃)和扩增体系:25μL PCR反应体积,包含1×Taq DNA酶缓冲液(10mmol/L Tris-HC l,50mmol/L KCl,0.1%Trion X-100,pH9.0),2.5 mmol/L MgCl_2,1.0-1.5U Taq酶,60ng模板DNA,0.4μmmol/L引物,dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4 mmol/L。(3).在此基础上,从44个ISSR引物中分别筛选出了适合于地黄、山药和大豆ISSR标记分析的引物10条、7条和8条;从80条RAPD引物中分别筛选出了适合于地黄和山药RAPD标记分析的引物17条和2条。(4).10条ISSR引物对10个地黄品种(系)扩增出110条带,多态条带比率(PPB)为71.82%,平均多样性指数(Ⅰ)为0.3577,遗传相似系数(GS)在0.557~0.979,平均GS为0.665;17条RAPD引物对10个地黄品种(系)扩增出177条带,多态条带比率(PPB)为61.58%,平均多样性指数(Ⅰ)为0.3135,遗传相似系数(GS)在0.63~0.93,平均GS为0.7545。两种分子标记的分析结果呈极显著正相关(r=0.649);利用2条ISSR引物对16个怀地黄单株扩增出17条带,多态条带比率(PPB)为64.71%。使用3条RAPD引物对16个怀地黄单株扩增出7条带,多态条带比率(PPB)为57.14%。(5).7条ISSR引物对28个山药品种扩增出65条带,多态条带比率(PPB)为83.01%,平均多样性指数(Ⅰ)为0.4379,遗传相似系数(GS)在0.33~0.96,平均GS为0.6246。2条RAPD引物对28个山药品种扩增出23条带,多态条带比率(PPB),为82.6%。(6).8个ISSR引物对10个大豆品种扩增出89条带,多态条


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