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《西北大学》 2006年
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离子交换法纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ的研究

薛文娇  
【摘要】：本文利用成本相对低廉的离子交换方法纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ(Human-like Collagen Bioprotein Ⅱ,HCB Ⅱ),将菌体经高压匀浆、沉淀、超滤浓缩,得到HCBⅡ的粗品,然后通过离子交换法进一步纯化,获得的HCB Ⅱ达到电泳纯。 通过对6种树脂进行静态筛选,得出阳离子交换树脂CM52对HCB Ⅱ的分离效果最佳。该树脂对HCB Ⅱ有较高的吸附容量和选择性:当pH为4.0缓冲液不加NaCl时,其对HCB Ⅱ的吸附量为54.8mg/g湿树脂,分离因数2.64。 CM52树脂对HCB Ⅱ的吸附平衡研究表明:HCB Ⅱ在CM52上的吸附基本符合Langmuir方程;pH、NaCl浓度对Langmuir方程参数影响较大;pH低于HCB Ⅱ等电点(pI=5.0)时,pH对吸附平衡的影响显著:即在4pH5范围内,随着pH增大,吸附容量减小,解离系数K_4增大;在3≤pH4范围内,随着pH增大,吸附容量增大,解离系数K_4减小,而pH大于等于5.0时Langmuir方程参数变化不明显;随着NaCl浓度增大,吸附容量减小,解离系数K_4增大;温度对Langmuir方程参数的影响较小,温度每升高10℃,吸附容量增加3%左右,解离系数K_d的变化不显著。 以CM52对HCB Ⅱ的吸附平衡数据为基础,优化了CM52对HCB Ⅱ的纯化工艺。通过实验,分别确定了静态吸附和柱层析吸附的操作条件,即静态吸附:在pH4.0、NaCl0.15mol/L、进料浓度为7g/L,处理量为17.26mL/g的条件下吸附60min:柱层析:在pH4.0、NaCl 0.15mol/L、进料浓度5g/L、流速5mL/min的条件下进行吸附。然后上柱,在pH4.0、NaCl 0.30mol/L下进行脱附。实验表明:采用静态吸附的方式吸附HCB Ⅱ,经上柱洗脱后,HCB Ⅱ的吸附量可达到48.6mg/(g树脂),回收率83.8%,操作时间短,分辨率高,最终纯化的HCB Ⅱ达电泳纯,相对分子量为97kD。 对CM52吸附HCB Ⅱ的动力学研究表明:搅拌速度和料液浓度决定了其动力学控制机理。以简单线性推动力模型拟合膜扩散控制(film diffusion control,FDC)时的动力学数据,其线性关系良好,模型准确度较高;对于颗粒扩散控制(particle diffusion control,PDC)的吸附,则以粒内表面扩散控制模型拟合,求出表面扩散系数,模型较好的描述了CM52对HCB Ⅱ的PDC吸附。同时,考察了搅拌速度、溶液浓度和温度对FDC模型参数的影响以及溶液浓度和温度对PDC模型参数的影响。
【关键词】：重组类人胶原蛋白Ⅱ 离子交换 吸附 纯化 动力学
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：TQ464.7
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2006.090096
【目录】：
  • 摘要3-4
  • Abstract4-9
  • 第一章 文献综述9-29
  • 1.1 生化分离工程9-14
  • 1.1.1 生物下游加工过程的特点和方法9-10
  • 1.1.1.1 生物技术产物分离提纯的特点9
  • 1.1.1.2 生物技术产物分离提纯的工艺9-10
  • 1.1.2 生物技术下游过程设计的优化10-11
  • 1.1.2.1 减少分离纯化步骤10-11
  • 1.1.2.2 分离步骤和次序的合理设计11
  • 1.1.3 重组蛋白质的分离纯化11-14
  • 1.1.3.1 基因工程产品和传统生化产品回收方法的比较12
  • 1.1.3.2 重组蛋白质的分离纯化的基础和方法12-14
  • 1.2 离子交换分离工程14-24
  • 1.2.1 离子交换法在生物产品提取分离中的应用14-16
  • 1.2.1.1 离子交换法提取纯化蛋白质14-15
  • 1.2.1.2 离子交换法提取分离其它生物产品15-16
  • 1.2.2 用于蛋白质分离的离子交换剂类型16-18
  • 1.2.2.1 纤维素类[36]16-17
  • 1.2.2.2 葡聚糖类[36]17
  • 1.2.2.3 琼脂糖类[37]17-18
  • 1.2.3 离子交换平衡18-20
  • 1.2.3.1 化学计量置换模型18-19
  • 1.2.3.2 双电层模型19
  • 1.2.3.3 吸附平衡模型19-20
  • 1.2.4 离子交换动力学20-24
  • 1.2.4.1 概述20
  • 1.2.4.2 离子交换机理20-21
  • 1.2.4.3 常用机理模型的交换速率方程式21-23
  • 1.2.4.4 经验模型[56]23-24
  • 1.3 重组类人胶原蛋白概述24-27
  • 1.3.1 胶原蛋白24-26
  • 1.3.1.1 胶原蛋白结构25
  • 1.3.1.2 胶原蛋白的应用及其局限性25-26
  • 1.3.2 重组类人胶原蛋白26-27
  • 1.3.2.1 重组类人胶原蛋白概述26
  • 1.3.2.2 国内外研究现状26-27
  • 1.4 本研究的目的及意义27-29
  • 第二章 实验材料、设备与测定方法29-36
  • 2.1 实验材料29
  • 2.1.1 试剂29
  • 2.1.2 主要仪器和设备29
  • 2.1.3 离子交换树脂29
  • 2.2 HCBⅡ粗品制备29-31
  • 2.2.1 菌体30-31
  • 2.2.1.1 供试菌种30
  • 2.2.1.2 培养基30
  • 2.2.1.3 摇瓶培养30-31
  • 2.2.1.4 分批-补料培养31
  • 2.2.1.5 菌体收集31
  • 2.2.2 产物的粗分离31
  • 2.2.2.1 细胞破碎31
  • 2.2.2.2 粗分离31
  • 2.3 分析方法31-36
  • 2.3.1 总蛋白含量的测定31-32
  • 2.3.1.1 试剂31-32
  • 2.3.1.2 蛋白质标准曲线的制定32
  • 2.3.1.3 蛋白质含量的计算32
  • 2.3.2 类人胶原蛋白Ⅱ的检测32-36
  • 2.3.2.1 定性测定32-33
  • 2.3.2.2 定量测定33-36
  • 第三章 离子交换树脂的选择36-41
  • 3.1 树脂选择的理论基础36-37
  • 3.2 实验方法与条件37-38
  • 3.2.1 树脂的预处理37
  • 3.2.2 静态实验方法37
  • 3.2.3 实验条件的选择37-38
  • 3.3 结果与讨论38-40
  • 3.3.1 阳离子交换树脂吸附除去杂蛋白的性能38-39
  • 3.3.2 离子交换树脂吸附HCBⅡ的性能39-40
  • 3.4 结论40-41
  • 第四章 CM52树脂对HCBⅡ的吸附平衡41-48
  • 4.1 实验方法41-42
  • 4.1.1 静态吸附吸附时间的选择41
  • 4.1.2 离子交换平衡41-42
  • 4.2 结果与讨论42-46
  • 4.2.1 静态吸附吸附时间的选择42
  • 4.2.2 pH对平衡等温线的影响42-43
  • 4.2.3 盐浓度对平衡等温线的影响43-45
  • 4.2.4 温度对平衡等温线的影响45-46
  • 4.3 结论46-48
  • 第五章 离子交换法HCBⅡ的工艺优化48-55
  • 5.1 实验方法48-49
  • 5.1.1 HCBⅡ吸附阳离子交换树脂CM52的盐浓度选择48
  • 5.1.2 静态吸附吸附时间的选择48
  • 5.1.3 柱层析48
  • 5.1.4 洗脱48-49
  • 5.2 实验结果与讨论49-53
  • 5.2.1 阳离子交换树脂CM52吸附HCBⅡ的PH选择49
  • 5.2.2 HCBⅡ吸附阳离子交换树脂CM52的盐浓度选择49
  • 5.2.3 阳离子交换树脂CM52对HCBⅡ的吸附等温线49
  • 5.2.4 静态吸附49-51
  • 5.2.4.1 静态吸附吸附时间的选择49-50
  • 5.2.4.2 进料浓度的选择50
  • 5.2.4.3 处理量的选择50-51
  • 5.2.5 柱层析吸附51-53
  • 5.2.5.1 流速对吸附的影响51-52
  • 5.2.5.2 进样浓度对吸附的影响52-53
  • 5.2.6 洗脱53
  • 5.3 结论53-55
  • 第六章 CM52吸附HCBⅡ的动力学研究55-64
  • 6.1 概述55
  • 6.2 控制机理的判断[56,91]55-58
  • 6.2.1 基本原理55-56
  • 6.2.1.1 中断接触法55-56
  • 6.2.1.2 间接判断法56
  • 6.2.2 实验方法56
  • 6.2.2.1 中断接触法56
  • 6.2.2.2 动力学静态吸附实验56
  • 6.2.3 实验结果与讨论56-58
  • 6.2.3.1 不同搅拌速度下的控制机理56-58
  • 6.2 3.2 不同浓度下的控制机理58
  • 6.3 动力学模型基本原理58-59
  • 6.3.1 液膜扩散控制(FDC)58
  • 6.3.2 颗粒扩散控制(PDC)58-59
  • 6.4 实验结果与讨论59-63
  • 6.4.1 液膜扩散控制(FDC)59-61
  • 6.4.1.1 温度的影响59-60
  • 6.4.1.2 搅拌速度对模型参数的影响60-61
  • 6.4.1.3 料液浓度对模型参数的影响61
  • 6.4.2 颗粒扩散控制(PDC)61-63
  • 6.4.2.1 温度的影响61-62
  • 6.4.2.2 溶液浓度的影响62-63
  • 6.5 结论63-64
  • 建议与展望64-65
  • 符号说明65-67
  • 参考文献67-71
  • 致谢71
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