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《西北大学》 2006年
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紫杉二烯合成酶及肿瘤血管生成抑制因子基因克隆与转基因研究

李红民  
【摘要】:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的第二大杀手,寻找对肿瘤细胞具有高杀伤力而对正常细胞毒副作用小的新型抗肿瘤药物,具有非常重要的现实意义。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜类化合物赤霉素的代谢途径构建能够表达生产紫杉醇前体的重组赤霉菌,为20世纪人类发现的最重要的新型抗癌药物二萜类化合物紫杉醇开辟新的药源途径,为缓解药源短缺对紫杉醇应用范围进一步扩大造成的严重限制提供理论和技术依据;另一方面,为新一代抗肿瘤活性分子肿瘤血管生成抑制因子Arresten寻找安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白表达生产系统。 Ⅰ 采用RT-PCR方法从红豆杉胚性愈伤组织细胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全长cDNA。将可以在大肠杆菌BL21s中表达、序列正确的紫杉二烯合成酶基因全长cDNA引入表达载体pAN52-1Not的起始密码子ATG下游,并将选择标记潮霉素B抗性表达框引入pAN52-1Not完整转录单位的侧翼区域,获得紫杉二烯合成酶基因cDNA表达载体pANts-hyg。 Ⅱ 采用PCR扩增法从赤霉菌基因组中克隆了赤霉素生物合成途径中第一个特异性关键酶——内根-贝壳杉烯合成酶基因cps的部分序列作为同源片断,以平端连接的方式引入丝状真菌表达载体pCSN44的HindⅢ位点,获得旨在中断赤霉素生物合成途径的cps基因打靶载体pCSNcps。 Ⅲ 通过单因素实验建立了本实验用赤霉菌菌株原生质体制备方法。研究结果表明,以10ml含15%粗制崩溃酶的酶解体系于37℃酶解4h,6个实验用赤霉菌受试菌株的原生质体产量都可以达到10~6/mL,能够满足遗传转化操作的需要,而使用溶壁酶制备实验用赤霉菌菌株原生质体的产量不足10~3/mL。 Ⅳ 建立了适用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生质体/PEG法转化体系,通过原生质体/PEG转化法获得少量赤霉菌转化子。经过PCR检测及Southern blot杂交检测,证实本研究采用原生质体/PEG法以pANts-hyg转化获得一株基因组整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌转化子和4株pCSNcps转化、潮霉素B抗性水平高于亲本菌株的赤霉菌转化子。整合有外源基因的赤霉菌转化子的生长形态和生长能力与亲本菌株相比存在显著差异。而且,随着传代次数的增加,
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S567.19

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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8 李松;米根霉CICIM F0071α-淀粉酶:基因克隆、鉴定与异源表达[D];江南大学;2011年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 姚秋林;水稻根特异表达启动子的克隆及功能分析[D];华中农业大学;2010年
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8 许慧敏;湘产南方红豆杉中紫杉烷类化合物的提取分离及含量测定[D];湖南中医药大学;2010年
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10 贾丹丹;毛脉酸模内生真菌抗肿瘤药效及其生物学特性的研究[D];黑龙江中医药大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王艳青,陈雪梅,李悦,蒋湘宁,刘群录,李素艳;植物抗逆中的渗透调节物质及其转基因工程进展[J];北京林业大学学报;2001年04期
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 吴长艾;棉花液泡型Na~+/H~+逆向运转体基因的克隆、功能鉴定及其在耐盐性中的重要作用[D];山东农业大学;2004年
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中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 耿其芳;农杆菌介导AtNHX1基因转化蓝浆果的研究[D];南京农业大学;2004年
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3 王国良;农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测[D];甘肃农业大学;2004年
【二级引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 王英娟;褪黑素合成酶基因对烟草和贯叶连翘的转化及转基因植株抗氧化能力的增强[D];西北大学;2008年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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6 刘春华;杉木酸枣人工混交林生产力和林木生长规律的研究[J];福建林业科技;1998年02期
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