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《西北大学》 2007年
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基于金磁微粒标记技术的可目视化蛋白质芯片检测方法的建立及应用

唐金凡  
【摘要】: 蛋白质芯片也叫蛋白质微阵列,是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于特定的载体表面,根据蛋白质分子间的特异性结合原理,对靶分子实现高通量、高灵敏度、微型化检测,在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示了巨大的潜力。目前,蛋白质芯片的检测方法主要有荧光标记和免疫金-银染色法,其中以胶体金作为蛋白标记物结合银增强染色法应用于蛋白质芯片检测,灵敏度高,并可目视化判读结果。但是胶体金标记蛋白质的过程复杂、繁琐,标记的蛋白质不能定量。 本研究用金磁微粒(GoldMag particles)作为一种新的蛋白标记技术,结合银增强染色方法建立可目视化蛋白质芯片的检测体系。金磁微粒是Fe_3O_4包被金颗粒后形成的纳米级磁性复合微粒,除具有超顺磁性、磁响应性、悬浮稳定性等特点外,还具有胶体金的特性。金磁微粒标记技术方法简便,操作简单,标记效率高,标记的蛋白质可定量。 本文首先以人IgG和羊抗人IgG为模式蛋白,将人IgG固定于环氧基修饰的玻片上制备蛋白质芯片,通过封闭、与金标羊抗人IgG孵育,结果经银染显色进行信号放大,产生可目视化的黑色点阵。通过优化条件,建立了可目视化蛋白质芯片检测体系,确定了以下最佳实验条件: (1)选择GPTS玻片作为本实验的载体。 (2)最佳点样浓度为0.1-0.2mg/mL。 (3)点样后玻片固定蛋白的条件为37℃,1-2h。 (4)抗原抗体的反应时间为30min。 (5)以1%BSA作为封闭剂。 (6)银染显色时间为10-15min。 按照优化后的条件,将该方法应用于HCV抗体的检测,分析了该体系的检测限和特异性,检测了经ELISA验证的10例健康人血清和6例HCV阳性血清。结果表明:该体系简便、快捷、特异性强,阴性和阳性检测结果与ELISA相符。 通过比较金磁微粒和胶体金标记技术在可目视化蛋白质芯片检测方法中的优劣,结果表明,胶体金检测方法灵敏度高,但是非特异性强,容易产生假阳性结果;金磁微粒的粒径较大,金密度小,银染作用不强。但是金磁微粒非特异性吸附弱,假阳性率低,而且金磁微粒标记蛋白质的过程简单,标记的蛋白可以定量,随着金磁微粒制备技术的发展,其在可目视化蛋白质芯片检测中具有巨大的应用潜力,并可推动蛋白质芯片技术尽快应用于临床检验。
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q819

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