秦艽及其近缘种的ISSR和HPLC研究

【摘要】： 秦艽(Gentiana macrophylla Pall)、麻花艽(Gentiana straminea Maxim)和小秦艽(Gen-tiana dahurica Fisch)隶属于龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana L.)秦艽组(Sect. Cru-ciata Gaudin),均为2005年版《中华人民共和国药典》收录的中药材秦艽原植物。目前有关秦艽药材的化学、药理学等方面的研究已有较多报道,但对秦艽原植物的DNA指纹鉴定、以及关于优良秦艽品种的筛选却少有报道。本课题在前人研究工作基础上,采用ISSR分子标记并结合HPLC指纹图谱,对小秦艽、秦艽和麻花艽进行了研究。目的是：(1)通过ISSR比较分析小秦艽、秦艽与麻花艽DNA指纹图谱,探讨三种秦艽药原植物DNA分子间的差异,从中筛选得到鉴别三种秦艽药原植物数据,并探究三者之间的亲缘关系,为秦艽药原植物的鉴定提供科学依据。(2)通过HPLC色谱比较分析两种叶型栽培秦艽的龙胆苦苷含量的差异,探讨秦艽形态与龙胆苦苷含量的关系,为建立秦艽优良品种选育方法与选育秦艽优良种质资源提供依据。 1.采用ISSR分子标记方法,对秦艽(Gentiana macrophylla Pall)、麻花艽(G.straminea Maxim)和小秦艽(G. dahurica Fisch) 3种药原植物的13个居群进行DNA指纹图谱的研究,结果表明：从60条ISSR引物中筛选出12条引物,以此共扩增出176条DNA条带,其中168条为多态性条带,多态性位点比率为95.45%；其中小秦艽、秦艽与麻花艽各具1条特异性条带,据此获得了能有效区别三种秦艽的多态性ISSR指纹图谱；此外,在小秦艽居群内,仅X-QQ具有UBC810的358bp条带,以此可与其他小秦艽居群相区别；麻花艽和小秦艽优先聚为一支,而后秦艽居群相聚成支,表明小秦艽和麻花艽亲缘关系较近,而与秦艽亲缘关系较远。 2.对秦艽(Gentiana macrophylla Pall)、麻花艽(G. straminea Maxim)和小秦艽(G.dahurica Fisch)3种药原植物13个居群的ISSR分析,结果表明：3种秦艽药原植物的13个居群形成2支,其中秦艽的6个居群(Q-HW、Q-SX、Q-XE、Q-SS、Q-ST和Q-SC)聚成一支,而另一支则包括了由云南省2个秦艽居群(Q-YZ和Q-YW)聚成的亚支、由4个小秦艽居群聚成的亚支和青海的麻花艽居群(M-QH)亚支等3个亚支。 为了研究秦艽的有效成分和其遗传结构的相关性,本文还利用HPLC化学标记对各居群进行了聚类,但聚类结果规律性较低。通过Mantel检测显示ISSR和HPLC两种标记结果的相关性不显著(r=0.16063)；对于三种秦艽龙胆苦苷的含量,秦艽(平均80.481mg/g)麻花艽(平均68.600 mg/g)小秦艽(平均36.168 mg/g)。 3.通过统计检验得知：宽叶型秦艽与窄叶型秦艽龙胆苦苷含量具有显著性差异性,后者较高,质量优；但由于宽叶型秦艽单株地下部分干重量(生物量)显著高于窄叶型秦艽,其地下部分龙胆苦苷产量高,因此其经济价值也较高。地上部分龙胆苦苷含量,窄叶型秦艽高于宽叶型秦艽。秦艽植株的地上与地下部分龙胆苦苷含量差异性极显著(t=30.492),地下部分的龙胆苦苷含量远高于地上部分。