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《西北大学》 2010年
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拟南芥EARLI1基因在生物和非生物胁迫中的抗性功能

徐丹  
【摘要】: EARLIl (early Arabidopsis aluminium-induced genel)属于HyPRP(hybrid proline rich protein)基因家族。HyPRP广泛存在于高等植物中,是富脯氨酸蛋白(PRP)的一个亚类。PRP是五类细胞壁结构蛋白中的一类,它们在植物细胞生长和发育过程中决定特殊的细胞壁结构,在植物受到物理伤害或病原体侵染时起防卫功能。本研究的目的在于通过表达调控、生理生化分析及形态观察,研究EARLI1在生物和非生物胁迫中的功能,为阐明细胞壁蛋白在逆境条件下的作用机制提供证据。 本工作通过卡那霉素抗性筛选得到了EARLI1过表达拟南芥转基因株系,采用RT-PCR和Northern印迹杂交技术对EARLI1基因的表达水平进行分析,结果表明转基因植株中EARLH基因的表达量相对于野生型个体明显提高。同时,通过PCR技术筛选得到多个EARLI1基因的T-DNA敲除纯合突变体。用基因两端的序列设计引物进行RT-PCR,在纯合敲除突变体中检测不到EARLI1全长mRNA,说明该基因已被T-DNA打断。Northern印迹杂交结果显示SAIL_86_A06 T-DNA纯合敲除突变体产生一条比野生型mRNA要小的条带,说明在突变体中不能转录产生完整的EARLI1基因mRNA。 以Col-0野生型拟南芥为材料分析各种胁迫因素对EARLI1基因表达的影响,RT-PCR及Northern印迹杂交结果显示EARLI1基因可以被NaCl诱导,其转录水平在一定程度上随NaCl浓度的提高而增加。比较过表达、敲除突变体及野生型拟南芥在不同浓度NaCl和甘露醇胁迫下的表型特征和生理指标,结果表明在一定程度上,过表达植株表现出更强的耐盐和耐旱性,而敲除突变体对盐和干旱的耐受能力与野生型个体相比明显下降。 Northern印迹杂交结果显示蒜薹灰霉菌(Botrytis cinerea Pers.ex of galic sprouts)接种处理可以诱导拟南芥EARLI1基因的表达。采用台酚蓝染色观察真菌侵染状况,发现蒜薹灰霉菌对过表达植株叶片的侵染程度比野生型个体叶片要轻,而敲除突变体植株叶片被侵染的程度较为严重。转EARLI1基因酵母在半乳糖诱导后与转空载体酵母相比生长速度明显下降,进一步说明EARLIl基因具有抗真菌的功能。表型及扫描电镜观察表明敲除突变体叶片更易被昆虫啃食。 通过农杆菌转化方法将EARLI1基因导入烟草(秦烟95),采用PCR、RT-PCR以及Northern印迹杂交技术对具有卡那霉素抗性的再生植株进行了鉴定,并以转基因烟草为材料进一步验证了EARLI1的耐盐性。
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