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《西北农林科技大学》 2010年
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银杏种仁抗菌蛋白基因工程研究及小麦胚乳特异启动子的鉴定和评估

刘缙  
【摘要】:本文分离纯化了一种来自银杏(Ginkgo biloba)种仁的抗真菌蛋白Gnk2-1,具有较强体外抗真菌活性且性质稳定。MALDI-TOF-MS鉴定,该蛋白与一种新型抗菌蛋白Gnk2(ginkbilobin-2)具较高匹配率(P0.05)。根据ESI-MS/MS内肽氨基酸测序结果设计简并引物,扩增该蛋白基因一段,经比对发现与Gnk2基因序列相似性也达99%。按照Gnk2基因序列设计同源引物,利用RT-PCR克隆该抗菌蛋白基因cDNA,序列分析表明其结构不同于任何其他已知的抗真菌蛋白种类;该蛋白中存在一种富含半胱氨酸的植物类受体激酶胞外结构域。为进一步研究该蛋白的体外抗菌机制,通过基因重组技术构建原核表达载体pGEX-GK2-1和pET-32-GK2-1转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot分析表明,GST融合蛋白在大肠杆菌中能够以包涵体形式大量表达,利用pET-32-GK2-1与含有DsbC基因的pAcycDuet1质粒共转化大肠杆菌细胞,SDS-PAGE和Western blot分析表明融合蛋白以部分可溶的形式存在于菌体上清液中。同时,为证明抗菌蛋白在体内的抗病作用,构建Gnk2-1组成型植物表达载体,利用根癌农杆菌介导转化黄瓜(Cucumis sativus L.)栽培品种农城3号。经PCR、RT-PCR及Western blot检测分析表明,目的基因已经整合到黄瓜基因组中并可稳定遗传,同时抗病性分析结果也首次证明了该蛋白基因在作物抗病改良上的应用潜力。 新型抗菌蛋白基因资源的开发,为转基因抗病种质的获得和蛋白抗菌防腐剂、生物农药、新抗生素的应用提供了基础材料。而利用谷物种子作为生物反应器生产特殊蛋白时,除需要这些具有应用价值的基因资源外,还需要拥有一些高效的胚乳专一性启动子。开发高效胚乳特异表达的启动子,不仅是基因工程技术改良谷物品质的基础,更是利用谷物种子作为生物反应器生产特殊蛋白的前提。 小麦Glu-1Bx14基因在胚乳发育过程中能够特异地高效表达,本文以小麦品种小偃6号为材料利用TAIL-PCR染色体步移技术克隆了该基因2.6kb 5’上游调控序列。GUS瞬时表达分析结果表明,该启动子片段具有胚乳组织特异的启动活性。序列分析表明,该调控序列中包括核心转录元件和多个潜在的胚乳特异表达转录元件以及远端核基质结合序列MARs (matrix attachment regions)。本文利用RLM-RACE法确定转录起始位点,并通过5’删减突变和报告基因瞬时表达分析,研究了该启动子上的功能区域。并在此基础上,选择包含必须增强元件的区域进行串联重复构建,经GUS瞬时表达分析表明,串联重复启动子的胚乳表达活性约为原始单拷贝启动子活性的2倍、35S组成型启动子的3倍,同时保留了胚乳组织特异性的特点。本文的目的在于试图寻找一个包含所有必须增强元件的合适启动子长度,并加以改造和利用。以期获得一个较为高效的谷物胚乳特异启动子,应用于谷物基因工程改良和胚乳生物反应器研究。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S664.3

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【参考文献】
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