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《西北农林科技大学》 2010年
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甘蓝型油菜Polima CMS和陕2A CMS的形态和生化特征及其胞质遗传物质的比较研究

朱彦涛  
【摘要】:细胞质雄性不育(CMS)是油菜杂种优势利用的重要途径之一,Polima CMS和陕2A CMS是两个经典实用的甘蓝型油菜(Brassica napus L.)细胞质雄性不育系,这两个著名的不育系在中国乃至世界油菜杂种优势的研究和利用中发挥了重要作用。有关这两个不育系的研究,过去主要集中在栽培、遗传以及杂种优势的利用方面,近年来,主要集中在不育机理和分子生物学研究方面。有关Polima CMS和陕2A CMS的深入研究,对进一步探索油菜CMS的分子机理,更好地利用这两个不育系为我国油菜科研和生产服务有重要意义。本论文对Polima CMS和陕2A CMS的国内外研究状况进行了综述,介绍了近年来这两个不育系的最新研究进展,并从形态解剖学、生理生化以及分子生物学方面对这两个不育系进行了比较系统的研究,为进一步深入研究这两个不育系提供了基本资料和依据。所取得的主要结果如下(为了描述方便,文中Polima CMS和陕2A CMS分别简写为PolA和陕2A,其相应保持系分别简写为PolB和陕2B): 1.分别对PolA系统(PolA、PolB)和陕2A系统(陕2A、陕2B)及其核质互换系、核代换系的形态学特征如植株的农艺性状和花器的形态解剖结构进行了比较研究。结果表明:陕2A系统与PolA系统的幼苗形态、花器结构和植株农艺性状明显不同,说明这两个不育系统具有明显不同的遗传背景。在核质互换和同核代换的条件下,这两个不育系与其同核异质材料之间的幼苗形态、花器结构和植株农艺性状分别无明显差异,而这两个不育系与其同质异核材料之间则明显不同,说明植株的表型性状主要是由其核基因组所控制的。 2.以PolA及其保持系PolB、陕2A及其保持系陕2B四个材料初花期的叶片、叶柄以及花蕾组织为材料进行酯酶(EST)同工酶和过氧化物酶(POD)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结果表明,不育系与其相应保持系的叶片、叶柄的EST同工酶谱均无明显差异,但其花蕾的EST同工酶谱有一定的差异;PolA与陕2A两个不育系对应器官的EST同工酶谱表现为明显差异。不育系与其相应保持系的叶片、叶柄的POD同工酶谱均无明显差异,但其花蕾的POD同工酶谱却有明显的差异;两个不育系对应器官的POD同工酶谱也明显不同。因此,这两个油菜CMS系统有着不同的遗传背景。 3.以PolA及其保持系PolB、陕2A及其保持系陕2B四个材料的幼苗叶片提取叶绿体DNA(cpDNA),并对cpDNA几个特异基因片段进行了PCR扩增。结果表明,5对油菜cpDNA特异基因的引物分别在四个材料中扩增出相同的一条带,而且扩增产物的大小与预期目的片段的大小一致。进一步对其中与光合作用有关的RubisCO大亚基(rbcL)基因进行了分子克隆和测序,结果显示,这四个材料的rbcL基因序列完全相同。采用4种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ分别对这四个材料的cpDNA进行酶切和电泳检测,酶切片断的多态性比较分析结果也显示,四个材料之间的带型分别一致,酶切结果无明显差异。本研究的结果也反映了cpDNA的保守性。 4.分别以PolA及其保持系PolB、陕2A及其保持系陕2B四个材料幼苗的根和叶提取线粒体DNA(mtDNA),并对所提取的mtDNA进行检测。结果表明,在同等条件下幼根所提取的mtDNA含量为3250ng/gFW,约为幼叶所提取mtDNA含量的6.5倍,显著大于叶片所提取的mtDNA,而且所提取的mtDNA纯度较高。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,油菜幼根所提取的mtDNA较幼叶所提取的mtDNA有更为清晰的条带。油菜线粒体基因的PCR扩增结果表明,幼根所提mtDNA扩增条带的重复性和稳定性也优于幼叶所提mtDNA。因此认为,用油菜幼根提取mtDNA是一条较好的途径。 5.分别以与油菜育性有关的5个mtDNA基因片段设计引物,对PolA系统和陕2A系统四个材料的mtDNA进行了PCR扩增。结果显示:有3个基因的引物在四个材料中分别扩增出相同的一条带,且扩增产物与预期目的片段的大小相一致,其中基于orf474 and orf159基因的引物还在四个材料中扩增出另一条相同的分子量稍小的条带;基于orf158基因的引物未能扩增出预期的目的片段;基于orf224基因的引物在PolA和陕2A两个不育系中扩增出相同的一条带,且扩增产物与预期目的片段的大小相一致,测序结果表明二者DNA序列也完全相同,均为675bp。另外,基于orf224基因的引物在PolB和陕2B两个保持系中扩增出相同的一条分子量较小的条带,经测序确认为与orf224不育基因有一定同源性的DNA片段,其大小为323bp。因此,推测保持系和不育系的多态性片段可能与CMS的育性有关。 6.采用基于油菜品种Westar的mtDNA全基因组的连续25个DNA片段的特异性引物,分别对PolA系统和陕2A系统四个材料的mtDNA模板的相应DNA区段进行了分段PCR扩增和电泳检测。结果表明,这四个材料mtDNA的组成结构和排列顺序与已知油菜品种Westar的mtDNA基因组序列相似,其mtDNA全长约为200kb。其中有11对引物在四个材料之间分别扩增出相同的1条带,而且扩增产物与预期目的片段的大小相一致,说明这些区段可能比较保守,这些区段的大小约占mtDNA全长的44%;有2对引物在四个材料之间分别扩增出相同的1条带,但其扩增产物与预期目的片段的大小不一致;有1对引物在四个材料中没有得到扩增产物。由于以上这些引物在四个材料之间扩增产物的带型分别相同(或没有得到扩增产物),因此预测这四个材料之间的同源性至少为56%。然而,其余一些引物在四个材料之间的扩增产物比较复杂,这些引物的扩增区域约覆盖mtDNA全长的44%,属于mtDNA重组的易变区。其中有些引物在不育系与保持系之间扩增出了差异片段,有些引物在PolA和陕2A之间扩增出了差异片段。但是,这些差异片段的生物学功能如何?以及这些差异片段是否与不育有关?还有待于进一步的深入研究。 7.本论文从分子生物学(如cpDNA和mtDNA特异基因的PCR扩增、测序比对以及cpDNA限制性酶切分析)、生理生化(如EST和POD同工酶电泳)以及形态解剖学(如植株农艺性状考种和花器形态结构观察)三个不同水平上对PolA和陕2A两个不育系进行了比较系统的研究。总体结果表明:PolA和陕2A两个不育系的核背景明显不同,mtDNA有一定的差异因而细胞质也有所不同,但PolA和陕2A的不育基因orf224序列则相同。那么,这两个不育系的不育机理是否完全相同?陕2A的mtDNA上是否还有其它不育基因的存在?等等,还有待于进一步的深入研究。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S565.4

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【参考文献】
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