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《西北农林科技大学》 2010年
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金属矿区及污水灌溉区抗重金属放线菌的筛选及吸附机理研究

林雁冰  
【摘要】:放线菌是土壤中的主要微生物类群之一,由于其特殊的细胞形态和生理代谢功能,放线菌在重金属的微生物修复中具有很大潜在的应用价值。本项目从重金属尾矿和污灌区土壤中分离筛选出具有重金属抗性的优良放线菌菌株,对其进行了多样性研究,并对潜在的新种进行了多相分类鉴定。通过正交试验优化了菌体对镉和锌的吸附条件,并在高效、稳定的优化条件下进行了吸附动力学研究,同时采用多种手段研究了高效抗性菌株对镉和锌的吸附特征,初步阐明放线菌对镉和锌的吸附和抗性机理。本研究所取得的主要结论如下: (1)从不同重金属尾矿区和污灌区分离筛选出18株抗性放线菌,其中从铅锌矿区分离的菌株K42(=CCNWNQ0016~T)对Cd~(2+)和Zn~(2+)的耐受性最高,分别能在5.5 mmol·L~(-1)Cd~(2+)和6.0 mmol·L~(-1)Zn~(2+)的高氏1号液体培养基中生长。在固体培养基上,菌株K42耐受Zn~(2+)的能力最强,对锌的最大抗性水平(Maximum Resistance Levels,MRL)可达35 mmol·L~(-1),对镉的MRL为22 mmol·L~(-1)。 (2)采用经典分类法研究了18株抗性优良放线菌的多样性。结果表明它们均属于链霉菌属,并初步归为8个不同的颜色类群,分别为灰褐类群(5株)、金色类群(3株)、蓝色类群(3株)、灰红紫类群(2株)、白孢类群(2株)、淡紫灰类群(1株)、黄色类群(1株)和烬灰类群(1株)。通过16S rDNA序列分析所构建的系统发育树,最终确定了18株代表菌的进化地位,其中发现菌株K42、H31、K44和K30为潜在的新种。通过培养特征及形态特征观察,重金属污染区土壤中还存在非链霉菌属菌株,对这些非链霉菌的16S rDNA序列分析,结果表明,8株菌分属于6个菌属,分别为小单孢菌属( Micromonospora )、链孢菌属( Catellatospora )、链孢子囊菌属(Streptosporangium)、游动放线菌属(Actinoplanes)、野野村菌属(Nonomuraea)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。其中,菌株K55、H1和H6与其模式株的相似性较低,在97.83%和98.65%之间,推断是潜在新种。 (3)采用多相分类法对菌株K42和H31进行了新种鉴定。菌株K42,即CCNWNQ 0016~T (= ACCC 41871~T=HAMBI 3107~T)分离自铅锌矿尾矿区,命名为Streptomyces zinciresistens,革兰氏阳性菌,好氧,抗锌、镉能力较强,其最大抗性水平分别为35 mmol·L~(-1)和22 mmol·L~(-1)。DNA的G+C含量是70.3 mol%。菌株H31,即CCNWHQ 0031~T(= CCNWTJ 0031~T=JCM 16925~T= ACCC 41873~T)分离自污水灌溉区,命名为Streptomyces shaanxiensis,革兰氏阳性菌,好氧,具有一定的重金属抗性,在高氏1号培养基上形成浅蓝灰色气生菌丝,深蓝色基内菌丝,产灰白色孢子堆,产生蓝色色素。DNA的G+C含量是70.7 mol%。 (4)不同重金属对高效抗性菌株K42的毒性顺序为Cu~(2+)Ni~(2+)Cd~(2+)Zn~(2+),菌株K42在pH 7和4%的NaCl浓度时生长最好;研究了影响菌株K42对镉和锌离子生物吸附能力的因素,结果表明,初始镉与锌离子浓度、初始pH和接种量对菌体生物吸附量和离子去除率的影响显著,摇床转速和吸附温度在统计学意义上对单位菌体生物吸附量和离子去除率无差异。根据单因素试验结果设计了正交试验并确定了抗性菌株K42对镉的最佳吸附条件为初始镉离子浓度2.0 mmol·L~(-1)(224 mg·L~(-1)),初始pH 4,接种量1%,去除率达91.56%,对锌离子吸附的最佳条件为初始锌离子浓度2.0 mmol·L~(-1)(130 mg·L~(-1)),初始pH 5,接种量1%,去除率达88.14%;而敏感菌株H7对镉和锌离子吸附的最佳条件为初始镉和锌离子浓度2.0 mmol·L~(-1),初始pH 5,接种量1%,去除率分别为90.33%和91.49%。菌体通过高温加热预处理后,能够提高菌体对镉和锌的吸附量。 (5)比较了抗性菌株和敏感菌株对镉和锌的吸附效果。抗性菌株K42对镉的去除率高于敏感菌株H7,而敏感菌株H7对锌的去除率高于抗性菌株K42。Langmuir和Freundlich两种平衡吸附模型对实验数据均能进行较好的模拟,Langmuir方程拟合效果更好,二级动力学模型能更好地模拟抗性菌株K42和敏感菌株H7对镉和锌的生物吸附过程。在pH为2时,2株菌对镉的解吸附效果最好,解吸附率达98.11%和88.55%,pH为1时,对锌的解吸附效果最佳,解吸附率为87.33%和76.45%。多种离子共存均能抑制供试菌株对镉和锌的生物吸附作用,尤其Cu~(2+)和Cr~(3+)协同的抑制作用最强。 (6)采用多种方法研究了菌株K42对镉和锌的生物吸附及耐受的机理。细胞壁是抗性菌株K42吸附重金属镉和锌的主要部位,其次是细胞内累积,且主要在生长对数期,在生长的菌体中,细胞表面对Cd~(2+)和Zn~(2+)的吸附量最少。抗性菌株K42在未添加重金属和添加重金属的培养液中生长是一个产碱的过程,且添加重金属后产碱量增加,使培养基pH由6.77增加到8.17。通过扫描电镜和透射电镜观察,发现加载重金属的菌体细胞形态和细胞内均有变化。扫描电镜发现加载低浓度镉和锌的菌体表面存在絮状物质沉淀,加载高浓度镉和锌后菌体细胞发生畸变,部分菌丝发生断裂或聚集,菌丝表面产生大量晶体或球形沉淀。透射电镜发现菌丝细胞的体积变小,细胞内聚集大量的电子密度颗粒,同时胞内透明胞囊数目减少或消失。能谱分析结果表明,细胞表面形成的沉积物中存在大量的镉和锌,细胞内存在锌的复合物。红外光谱分析表明,细胞表面的镉和锌主要与–OH、–NH2、–COOH、–CO–NH–、–CN等相关的功能基团结合。Ni~(2+)的存在促进细胞壁上的活性吸收位点可能增多,从而提高细胞壁的吸附功能,Cu~(2+)的存在抑制更多的基团活性,从而减少对镉和锌离子的吸附。
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