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MEF2A基因原核表达系统构建及黄牛MEF2A、DLK1和CLPG基因遗传分析

陈付英  
【摘要】:本研究以南阳牛、秦川牛、郏县红牛、晋南牛、安格斯牛、中国荷斯坦牛、牦牛和水牛8个群体共1223个个体为材料,采用生物信息学、DNA双向测序技术、DNA序列分析、F-PCR-RFLP和PCR-SSCP分子标记技术,检测了MEF2A、DLK1和CLPG三个基因18个位点的遗传变异,分析了其遗传结构和遗传多样性,并将南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体在上述基因位点的多态性与其生长性状进行了相关分析,以期获得相应的分子遗传学信息,探索这些基因的多态对3个黄牛群体生长发育的遗传效应,找到对重要经济性状具有显著效应的遗传标记,为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。同时通过基因工程技术构建了黄牛MEF2A基因原核表达系统,实现了MEF2A基因在大肠杆菌中的成功表达,为进一步研究其功能奠定基础。本研究获得了以下结果: 1.MEF2A基因的克隆、表达及生物信息学分析 成功克隆黄牛MEF2A基因完整编码区(CDS)和1.2 Kb的3'UTR区,CDS区全长1494bp,编码498个氨基酸。生物信息学软件预测表明:该蛋白分子量为53.38 kDa,理论等电点为7.13。MEF2A蛋白包括三个重要部分:N端是高度保守的MADS-box(第1~56位氨基酸肽段)和MEF2(第57~86位氨基酸肽段)结构域,C端转录激活域存在差异;3'UTR区包括与mRNA稳定性有关的AU(ATTTA)序列。构建pET-MEF2A原核表达载体,经过IPTG诱导,在体外成功表达。 2.MEF2A基因的变异位点 本研究共设计了12对引物检测了MEF2A基因的9个外显子和1.1 Kb的3'UTR部分区域,检测到6个SNP位点,其中5个在外显子11,一个在3'UTR。在第11外显子的E11-A位点的C1598T突变,导致第420位氨基酸发生了ProLeu变化,其它4个突变均为同义突变(P420P、P421P、E434E、P465P)。G2032C突变位点位于3'UTR。突变间的连锁分析表明,C1598T突变位点和A1602G突变位点存在一定的连锁关系。 3.MEF2A基因基因遗传变异位点与生长性状的关系 MEF2A基因的6处突变均影响个体的早期生长性状。E11-A位点C1598T错义突变影响12月龄的胸围(P0.05),E11-B位点G1641A突变影响12月龄日增重(P0.05),E11-C位点C1734T突变影响6月龄体重和6月龄日增重(P0.05),E11-D位点G1599A突变影响12月龄日增重(P0.05),3'UTR位点G2032C突变影响南阳牛6月龄的体重、体高、体长和胸围。 4.DLK1的遗传分析 本研究共涉及DLK1基因外显子2~5和3'UTR。该基因编码区高度保守,在秦川牛和南阳牛群体中,外显子5发生了一个C451T同义突变,低度多态,处于哈代-温伯格平衡状态,在其它群体中没有发现突变。在3'UTR区发现一个碱基突变和两种碱基C缺失模式。在3'UTR区,秦川牛发生了C1103T突变,南阳牛发生了1104位碱基C缺失,郏县红牛发生了1104-1105位碱基C缺失。相对于黄牛,水牛3'UTR区的碱基1087和1088之间插入一个碱基T,1089位碱基发生CT突变。 E5-A所有指标优于E5-B,但未达到显著水平(P0.05)。其它群体未检测到多态。3'UTR位点检测到突变,显著影响12月龄胸围(P0.05),突变个体的该项指标低于纯合野生型个体。 DLK1蛋白的分子量大约为33.01 kD,理论等电点为4.466,DLK1是1型膜蛋白,氨基末端外表皮生长因子样结构域(25~206 aa),其次是一个相对较小的细胞外阳性膜区(59氨基酸),一个跨膜域(230~252 aa)和一个小的羧基端细胞质域(56氨基酸)。二级结构的两端以α螺旋为主,中间部分以β折叠为主。 5.牛的CLPG基因的遗传分析 分析了包括黄牛、牦牛和水牛3个牛属的8个群体,在秦川牛上发现C137T突变,检测到两种基因型AA和AB,突变杂合子AB型显著降低胸深指标(P0.05)。CLPG基因的序列在不同的属种存在AT-CG碱基转换。黄牛和水牛之间发现4处碱基转换,黄牛和牦牛之间仅存在一处碱基转换。


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