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《西北农林科技大学》 2011年
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山羊乳腺上皮细胞转人β防御素3基因的研究

杜珊  
【摘要】:近年来体细胞核移植技术已被广泛应用于转基因动物的研究。其中,乳腺上皮细胞是乳腺生物反应器的靶细胞,外源重组基因经翻译修饰可在乳腺上皮细胞中合成具有生物活性的外源蛋白,因而乳腺上皮细胞是检测乳腺特异性表达载体表达能力的一条有效途径。本研究针对人β防御素3基因(humanβ-defension-3, hβD3)乳腺特异性表达载体转染山羊乳腺上皮细胞的关键环节进行了系统研究。原代分离、培养了山羊乳腺上皮细胞,运用pEGFP-C1载体通过不同的转染方法转染山羊乳腺上皮细胞,筛选出乳腺上皮细胞的适宜转染条件,采用适宜转染条件进行人β-防御素-3基因的转染,经G418筛选后得到稳定转染hβD3基因的乳腺上皮细胞,并利用PCR, Southern blot和Western blot技术鉴定目的基因在细胞中的整合及表达。结果如下: 1.采集泌乳期健康奶山羊乳腺组织四组,通过组织块贴壁倒置培养法分离山羊乳腺上皮细胞,原代培养的山羊乳腺上皮细胞中混杂有大量的成纤维细胞,试验通过细胞刮除,以及依据上皮细胞与成纤维细胞对消化酶敏感性不同的特性,用含0.25%胰蛋白酶/0.04%EDTA的细胞消化液在38℃条件下,利用选择性酶消化分离法进行乳腺上皮细胞的分离纯化,最终得到两组较纯的乳腺上皮细胞。 2.分离纯化所得细胞呈现鹅卵石样,是典型的上皮细胞特征。试验通过对细胞生长曲线测定,以及运用免疫组织化学方法对细胞进行角蛋白18表达鉴定,结果显示细胞生长曲线类似于“S”形,符合细胞生长的生物学规律,且分离培养的乳腺上皮细胞角蛋白18表达呈阳性。可以进行进一步基因转染条件筛选。 3.分别比较了在不同DNA含量(2, 4, 8, 10, 12 ug)、不同孵育时间(2, 4, 6, 10 h)以及不同遗传背景细胞(GMEC3, GMEC4)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下,脂质体介导的外源基因转染效率。同时对比了不同电压(120 , 140 , 160, 180, 200 V)、不同电击时长(5, 10, 15, 20 ms)以及两株细胞(GMEC3, GMEC4)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)的条件下的外源基因电转染效率,两组实验结果均显示不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,其中乳腺上皮细胞在电压180 V、电击时长15 ms、电击一次条件下的电转染效率最高。 4.利用试验所筛选的优化条件,对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选后,获得稳定表达EGFP基因的单克隆细胞,对获得的单克隆阳性细胞进行扩增培养。并使用PCR, southern blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株中外源基因的整合,用western blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株体外诱导表达产物中人β-防御素3蛋白的表达。结果表明,运用优化条件进行外源基因电转染、筛选和扩增后获得稳定整合人β-防御素3基因且表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q813.11

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【参考文献】
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