利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化研究

【摘要】：骨骼肌是由终末分化的多核肌纤维组成。因此,出生后骨骼肌的再生取决于未分化的单核肌肉祖细胞库,而卫星细胞是这个库的主要成分。卫星细胞是一种位于肌纤维膜表面与基底膜之间的,呈静息态的肌源性干细胞,具有增殖和成肌分化潜能,对骨骼肌内环境的稳定、肌纤维的肥大和损伤修复起着重要作用。在形态学上,它们呈梭形或卵圆形,具有高核质比和细胞器内含物少的特点。但是,谁来调控卫星细胞的自我更新或分化的认识才刚刚开始,目前认为静息期的卫星细胞表达Pax7转录因子,当它被激活后,同时表达Pax7和MyoD。当增殖完成后,大多数卫星细胞下调Pax7表达,同时进行分化。其它的子代卫星细胞仍然维持Pax7的表达但不表达MyoD,退出细胞周期重新回到静息状态。 单根肌纤维的分离,培养已经广泛用于研究卫星细胞基因的表达、成肌发育和肌肉再生过程中。由于分离,培养单根肌纤维消除了非肌肉细胞的影响,并维持了其静息状态,所以它的作用是非常强大的,而国内还尚未见报道。因此,本研究通过Ⅰ型胶原酶消化,从猪骨骼肌中分离完整的单根肌纤维并培养,用细胞免疫荧光鉴定肌纤维上的卫星细胞,随后对从单根肌纤维上游离出来的卫星细胞进行细胞免疫荧光染色,传代培养,生长曲线绘制,成肌诱导分化和Western blot分析骨骼肌卫星细胞成肌特异性蛋白的表达。其主要研究结果如下: 1.分离并培养的单根肌纤维上附着有卵圆形的细胞,并随时间的推移,细胞缓慢向外迁移并增殖,卫星细胞特异性标志基因Pax7和MyoD免疫荧光染色呈阳性,且阳性率达到90%以上。 2.在增殖培养基中添加1%的鸡胚提取物可以显著的促进骨骼肌卫星细胞的增殖;于不同时期,WB分析猪骨骼肌卫星细胞特异性蛋白表达发现,MyoD蛋白高表达于增殖期,而Myogenin和MyHC在进入分化期才表达。 3.在成肌诱导分化中,与用传统的DMⅠ分化培养基培养比较,DMⅡ分化培养基更利于细胞汇合,分化形成多核肌管,且成肌特异性标志基因Myogenin、MyHC表达量显著上调。 综上所述:该研究成功建立了猪骨骼肌单根肌纤维的体外培养方法并获得了高纯度的卫星细胞;其次,优化了猪骨骼肌卫星细胞的增殖、分化培养体系;最后,初步分析了猪骨骼肌卫星细胞中成肌特异性蛋白表达规律,为今后骨骼肌卫星细胞的迁移、增殖和分化机理研究提供了理想的实验材料。