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《西北农林科技大学》 2011年
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苹果杂交后代果实性状选择及抗斑点落叶病MdWRKY基因功能研究

樊红科  
【摘要】:苹果新品种选育以常规杂交育种为主,杂交后代选择研究是苹果育种研究的一个重要方面。分子标记技术作为一种新兴的研究手段,在苹果育种研究中能进一步补充与充实常规方法的研究内容与结果。WRKY转录因子是近年来在植物体内发现的特有转录调控因子,能够调控多个下游功能基因的表达,从而使转基因植物获得综合抗病抗逆能力,克隆和转化这些转录因子具有较高的应用价值。苹果早期落叶病是渭北黄土高原发生比较严重的一种苹果真菌性病害,已经成为苹果生长发育和产量形成的重要限制因子。因此克隆与此相关抗病基因并对这些基因进行表达特性分析及功能鉴定具有重要意义。本文以短枝富士和粉红女士杂交的216株F1代群体为试材,应用数学方法,对杂交后代果实性状选择研究进行了探索。应用简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)技术,对果实酸度基因(Ma)进行了分子标记研究。同时,对苹果斑点落叶病的综合评价及与其抗性相关MdWRKY基因功能进行了研究。获得的主要研究结果如下: 1.通过对富士、粉红女士及216株杂交F1代果实大小、风味、颜色等性状进行了统计分析,明确了双亲各果实性状的差异大小。同时对杂交后代果实性状遗传研究表明苹果果皮表色遗传表现为简单的质量遗传,红色遗传表现为多基因控制的数量遗传。果形表现了明显的趋中变异现象,果实大小、可溶性固形物(Soluble Soild Content, SSC)及含糖量(Total Sugar Content,TSC)呈退化的负向优势,后代群体有劣变趋势。杂交后代果实分别呈现肉质变粗、质地变硬、果汁减少的趋势。 2.以富士和粉红女士多年的果实性状平均表现和预期育种目标为基础,制订了杂交后代选择标准。以果色、果型、风味作为选择的主要依据,确定了单果重、果形指数、果实硬度、糖酸比等12个适宜性评价指标,采用5级评分制对各指标进行量化分级,运用层次分析法和熵值法确定了各指标的综合权重,提出了杂交F1代果实性状综合评价模型;运用改进列联表法,建立了杂交F1代果实丰产性状综合选择模式。 3.利用SSR标记,结合集群分类分析法(Bulked Segregation Analysis, BSA)进行了苹果酸度基因(Ma)分子标记研究。通过对102对SSR引物的筛选,获得了与果实酸性状紧密连锁的分子标记CH03d12-104和CH03d12-118,连锁距离分别为3.24cM和2.31cM。分子遗传表明果实含酸量受一对主基因和一对加性基因控制, Ma对ma表现为完全显性。将获得的标记在40个栽培品种中做了进一步验证,基因型与表型性状符合率为97.5%。证明了该标记在苹果酸性状验证的准确性,进一步讨论了该标记在苹果品质育种辅助选择中的应用。 4.苹果杂交后代斑点落叶病抗性生理指标的综合评价及预测。以富士与粉红女士杂交F1代为试材,将苹果各生理指标的抗斑点落叶病系数,作为衡量苹果单项抗病能力大小的指标,用主成分分析法将各单项抗病系数综合成几个新的相互独立的综合指标,再利用隶属函数求出每一单株抗病性的综合评价值,以此评价各杂交F1代的抗病性。同时建立了植株抗病性综合评价值与单项指标抗斑点落叶病系数间的最优回归方程。杂交F1代单株抗病性综合评价值越高,抗病性越强。叶片净光合速率、绿原酸含量、苯丙氨酸解氨酶含量和百叶厚4个指标,可以作为苹果抗斑点落叶病的鉴定指标。回归分析表明,所建方程相关性显著,方程预测值的聚类分析结果与各株抗病性强弱顺序一致,所建回归方程能够预测苹果杂交后代个体的抗病性。 5.苹果抗斑点落叶病MdWRKY基因功能研究。采用反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)方法从抗苹果斑点落叶病的秦冠苹果中克隆到一个WRKY基因,全长1224bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY,GenBank登录号为HM859901。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。酵母体内的转录激活实验表明,MdWRKY在酵母细胞中具有转录激活功能。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其参与植物与病原菌的互作。半定量分析结果显示,MdWRKY被水杨酸(Salicylic Acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)转录诱导,表明MdWRKY基因参与了SA和MeJA在抗病防御反应中的信号传导。MdWRKY基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草抗烟草黑胫病能力,表明MdWRKY基因具有一定的抗病功能。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S661.1

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