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《西北农林科技大学》 2011年
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19-去甲睾酮免疫学检测方法的建立及应用

姜金庆  
【摘要】:19–去甲睾酮(NT)用于治疗骨质疏松症,蛋白质缺陷型疾病和烧伤等;它还可以提高运动员和赛马比赛的成绩,增强食源性动物瘦肉生产率。但NT及代谢物残留可引起人的肝、脑功能障碍、心血管系统受损和内分泌失调等副作用,因此在世界上多数国家,除医疗和科研之外,禁止使用。 NT残留检测的传统方法有气相色谱–质谱法(GC–MS),液相色谱质谱联用法(LC–MS)及其它定量检测方法。这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备,不适合大批量市场检测和现场监控。而免疫学检测技术灵敏高、特异性强、操作简单、价格低廉,能够实现对生物液体的小体积、大通量检测,逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法之一。 本文对NT人工抗原的合成、多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)的制备、间接竞争ELISA和直接竞争ELISA检测方法的优化、试剂盒检测性能及应用、免疫金标试纸条的研制和气质联用(GC–MS)确证法等进行了研究,主要结果如下: 1.丁二酸酐法衍生化NT,制备17β–19–NT琥珀酸酯半抗原,质谱和核磁共振1H–NMR谱表明合成成功。分别用EDC法和混合酸酐法将半抗原与BSA和OVA偶联,制备免疫抗原和检测抗原,并进行紫外扫描和红外光谱鉴定,NT与BSA偶联比为18:1。NT–BSA免疫Balb/C小鼠的抗血清效价达到1∶25600,间接竞争ELISA的IC50为27.3 ng/mL。纯化后的抗血清与α–NT的交叉反应率为69%,与其它激素的交叉反应率均0.05%。结果表明:人工抗原合成成功,为试剂盒和试纸条的研制提供基础材料。 2. NT–17–BSA免疫原制备兔抗多克隆抗体,用NT–3–OVA检测抗原包板,建立异源性间接竞争ELISA试剂盒。对NT的线性检测范围为0.06 ~ 31.2 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD)分别为1.55和0.04 ng/mL。检测缓冲液中pH值和磷酸根离子浓度的最佳参数分别为7.4 mM和10 mM;对甲醇和NaOH的最高容忍度分别为30%和10%。多克隆抗体对群勃龙和雌二醇的交叉反应率分别为9.6%和6.4%;猪尿、牛尿、狗尿和马尿简单稀释1∶20、1∶20、1∶20和1∶50可有效消除基质效应性;动物空白尿液基质中的添加回收率为85% ~ 110%,相对标准差为4.4% ~ 16.3%。试剂盒4℃下保存期至少6个月,温育过程优化后可节约检测时间30 ~ 90 min。 3.细胞融合技术筛选出5株NT mAb杂交瘤细胞株,命名为NT–1、NT–2、NT–3、NT–4和NT–5。细胞株单抗腹水效价为0.64 ~ 2.56×105,IC50为0.55 ~ 1.0 ng/mL;抗体为IgG1亚型,具k轻链;亲和常数(Ka)为2.6 ~ 4.7×109 L/mol。建立的icELISA标准曲线在PBS中的的线性检测范围为0.004 ~ 85.8 ng/mL,IC50值为0.55 ng/mL,检测限(LOD)为0.002 ng/mL;抗体与α–NT的交叉反应率(CR)为62%,与其它化合物无CR。ELISA方法和液质联用检测(LC–MS/MS)的相关性良好(R2 = 0.9871)。 4.细胞融合技术筛选出3B8–E6单克隆杂瘤细胞株,建立异源性直接竞争ELISA(dcELISA)检测方法,其线性检测范围为0.004 ~ 19 ng/mL,IC50值为0.28 ng/mL,检测限(LOD)为0.002 ng/mL。抗体与勃地酮和群勃龙的交叉反应率分别为6.9%和1.2%,与其它化合物无CR。标准曲线对甲醇有较高的容忍度(30%),而检测缓冲液中吐温–20的最佳含量为0.05%,乙腈和丙酮不能超过10%。4℃和–20℃保存条件下,试剂盒有效期分别为180 d和240 d。简单稀释法进行样品前处理可以消除基质效应,ELISA试剂盒和GC–MS检测的相关系数(R2)分别为0.9918(牛肉)、0.9834(牛肝)和0.9976(牛肾)。 5.研制NT残留检测的胶体金免疫层析试纸条。柠檬酸钠还原法制备直径15 nm的胶体金颗粒,pH 9.0条件下制备金标单克隆抗体复合物,竞争法原理组装检测试纸条。试纸条目测灵敏度为1.6 ng/mL,实际检测线确定为8 ng/mL,与群勃龙和勃地酮的交叉反应率(CR)分别为15.6%和7.8%,与其它化合物无CR。试纸条在4℃和室温条件下,有效期分别为12个月和6个月。 6.建立NT残留检测的GC–MS检测方法。动物组织在醋酸缓冲液中酶解,用甲醇提取,正已烷去脂,提取液经SPE–C18柱净化,使用七氟丁酸酐衍生化。电子轰击离子源(EI),不分流进样,阳离子电离(PCI),质谱图四个定量离子为m/z 666、453、318和306。在1 ~ 20 ng/g范围内,线性回归方程式为Y=– 68 354 + 467 084X (R2 = 0.9997)。动物组织中添加回收实验的回收率为63% ~ 101%,变异系数(CV)为2.7% ~ 8.9%。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S859.84

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