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《西北农林科技大学》 2011年
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小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用

孟书燕  
【摘要】:动物胚胎干细胞(ES)为研究早期胚胎发育、基因打靶、动物克隆和再生医学提供了种子细胞。但是,由于取材困难,培养条件不稳定等因素,大动物ES细胞的研究还面临很多困难。目前,人们发现通过导入外源多能性转录因子,可使体细胞重编程为多能状态,产生的细胞被称为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。iPS细胞的出现可避开ES细胞的困难,从而产生一种可代替ES细胞的多能干细胞。iPS细胞系已经相继在小鼠、人、恒河猴、大鼠、猪、兔、绵羊、山羊等动物中建立。本研究主要探讨小分子化合物对产生iPS细胞的影响。 1、小分子化合物对p-giPS细胞的重编程影响 本实验中,通过使用携带有小鼠多能性四因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc的逆转录病毒载体,转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblasts,GEF),在体外诱导培养后,得到山羊诱导多能性干细胞(goat induced pluripotent stem cells,giPS cells)。这些细胞具有扁平的人ES细胞样的形态,边缘整齐,细胞的核质比较大,AP检测阳性;能在体外长期培养,稳定传代,并且保持克隆形态不变;此外这些细胞还表达内源性多能因子Nanog,Sox2和TERT等基因,也表达阶段特异性表面抗原SSEA-4,不表达SSEA-1,TRA-1-60和TRA-1-81。但是这些细胞持续表达外源因子,不表达关键的多能因子Oct4基因,也不能在裸鼠体内形成畸胎瘤,因此我们认为这些细胞是部分重编程的多能细胞(partial goat induced pluripotent stem cells,p-giPS cells)。在诱导细胞重编程过程中,由于内源多能性因子的激活是随机性的,因此重编程的效率比较低,会产生大量的不完全重编程的细胞。而添加小分子化合物可促进细胞重编程的效率,使部分重编程细胞转变为完全重编程细胞。我们在山羊部分重编程细胞的培养液中添加小分子维生素C(Vc)和5-Aza-2′-Deoxycytidine (5-AzadC),结果发现添加小分子的实验组与对照组比较,其内源多能性因子Nanog,Sox2和TERT的表达量分别提高了4倍,6倍和10倍。但是,内源Oct4因子的表达未见上调,而且外源四因子的表达也未沉默。这一结果说明Vc和5-AzadC两种小分子能在一定程度上提高内源多能因子的表达水平,但未使之彻底转变为完全重编程细胞。 2、p-giPS细胞向心肌样细胞的诱导分化 本实验得到的p-giPS细胞具有多分化潜能,可在体外分化成为心肌样细胞,这些细胞表达心肌标记基因Nkx2.5,Gata-4,α-MHC和TNNi3。添加Vc和5-AzadC组的细胞与对照组相比,也具有分化为心肌样细胞的能力,但Nkx2.5,Gata-4和TNNi3的表达量在三种处理中有所不同,免疫荧光也显示三种处理下的细胞都表达Nkx2.5。上述结果说明,通过四因子诱导产生的山羊部分重编程细胞表达一些多能标记基因,但不是完全具有多能性,添加小分子Vc和5-AzadC后能提高多能性基因的表达水平,同时还具有分化为心肌样细胞的能力,这可为进一步研究山羊iPS细胞的发生过程提供帮助,从而有助于建立山羊ES细胞系和产生基因修饰的山羊。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S827;Q952

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