小麦与条锈菌互作过程中活性氧和防御基因的防御反应及抗病相关基因的鉴定与功能验证

【摘要】：小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis Westend f. sp. tritici Eriks. Henn.)引起的一种重要的小麦(Triticum aestivum L.)气传叶部病害,也是我国乃至世界上所有产麦国家危害最严重的世界性小麦病害之一。以多年来国内外专家学者的研究和生产实践证明,合理利用抗病基因,培育和推广高效、稳定、广谱、持久的抗病品种是控制与治理小麦条锈病最经济、安全、有效的途径。优良的抗病种质与基因资源是产生突破性抗病育种的物质基础;深入研究小麦的抗病机制,是抗病育种的必由之路;加强对小麦与条锈菌互作过程中的组织学、组织化学和分子生物学方面的研究,为阐明小麦与条锈菌互作的分子机制奠定了坚实的基础,对抗病防治和抗病遗传育种工作具有重要的理论和指导意义。 本文一方面,采用光学显微镜和组织化学研究方法,通过比较由携带Yr10的抗病小麦品种Moro和感病品种Fielder与条锈菌组成的非亲和与亲和体系互作反应的不同,阐明病原菌的发展、寄主的过敏性反应和活性氧(ROS)的积累在细胞学上的关系;并利用实时定量PCR (qRT-PCR),对一系列防御相关基因在非亲和与亲和组合中进行表达谱的研究,将细胞学反应与基因表达调控相结合,对Yr10介导的对条锈菌的防御反应中涉及的关键因素进行揭示。 另一方面,本文从实验室前期以小麦品种水源11与条锈菌生理小种CYR23为材料,利用抑制性差减杂交技术已经构建完成的非亲和条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库或NCBI小麦EST数据库中,共挑选了3个候选基因。通过电子克隆结合RT-PCR技术,克隆得到这3个基因全长序列,它们分别为:小麦含CBS结构域的蛋白基因、小麦EF-手型钙结合蛋白基因和小麦受翻译调节的肿瘤蛋白基因;通过生物信息学比对和分析了解这些基因的基本特征;利用qRT-PCR技术,分析这些基因在对条锈菌侵染的防御反应、非生物胁迫和环境影响等过程中的分子特征和表达谱;利用基因枪转化法在洋葱表皮细胞对小麦EF-手型钙结合蛋白基因和小麦受翻译调节的肿瘤蛋白基因进行瞬时表达,明确其亚细胞定位;运用BSMV-VIGS技术对小麦受翻译调节的肿瘤蛋白基因进行功能分析。通过这些实验,初步明确这3个基因在小麦与条锈菌互作体系中的分子生物学功能。具体研究内容和结果如下: 1.在小麦抗病品种Moro (携带Yr10抗条锈病基因)和感病品种Fielder中,至接种后6～12 d,条锈菌在叶片中的侵入和定殖非常相似。但是在此之后,Moro发生活性氧迸发和过敏性坏死反应阻止了病原菌的进一步扩展。在非亲和组合中,防御信号分子基因于接种后较早期2～6 d特异上调表达,病程相关蛋白(Pathogenesis-related Protein,PR-protein)基因则于接种后4～14 d有特异的上调表达。结果表明识别反应发生在寄主与病原菌互作早期,而阻止病原菌发展的关键的PR-蛋白介导的防御反应发生在互作后期。本研究是第一次在谷类锈菌中将详细的形态学方面的防御反应,包括活性氧迸发和HR,与已经注释的防御基因的表达谱相结合,以目前的寄主与病原菌互作模式阐明了Yr10和条锈菌的关系。 2.小麦含CBS结构域蛋白的基因TaCDCP1 (Triticum aestivum CBS domain containing protein 1),开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸;TaCDCP1拟编码的蛋白预测具有两个典型的CBS保守结构域,不含跨膜区,无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因在小麦叶中的表达量显著高于在根和茎中的;在小麦与条锈菌的非亲和与亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18～48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96～120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤、乙烯、赤霉素、茉莉酸甲酯和水杨酸处理后,其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上调,经机械伤害和高盐处理后表达量无明显差异。以上表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的防御反应。结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。 3.小麦EF-手型钙结合蛋白基因TaCab1 (Triticum aestivum calcium binding EF-hand protein 1),DNA序列没有内含子,开放阅读框651 bp,编码216个氨基酸;TaCab1拟编码的蛋白预测具有一个信号肽,一个跨膜区域,一个油体钙蛋白保守结构域(caleosin conserved domain)和一个单独的EF-手型基序;TaCab1与大麦中EF-手型钙结合蛋白基因BCI-4编码的蛋白同源性高达92 %;洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示TaCab1基因编码一个跨膜蛋白;TaCab1的表达可能受到钙离子浓度的调控;该基因在小麦叶中的表达量显著高于在根和茎中;尽管在非亲和与亲和组合中表达整体表现为相似的上调趋势,TaCab1在亲和组合中的表达量显著高于在非亲和组合中的;在水杨酸处理后2～24 h,TaCab1的表达整体保持上调,在其他不同激素和非生物胁迫处理下,TaCab1基因于处理早期被诱导,且均有不同程度的上调表达,但均无水杨酸处理后上调幅度大。以上表明,TaCab1可能通过水杨酸信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应负调控,同时参与对环境压力的基础抗性反应。这些结果揭示了TaCab1在小麦应对生物与非生物胁迫和条锈菌致病过程中发挥的作用,为进一步研究TaCab1在小麦与条锈菌互作中的特殊功能奠定基础。 4.小麦受翻译调节的肿瘤蛋白基因TaTCTP1 (Triticum aestivum translationally controlled tumor protein 1),该基因DNA序列全长1647bp,包含4个内含子序列和5个外显子序列;该基因开放阅读框为507 bp,编码168个氨基酸,预测其不含跨膜区,无信号肽;具有Mss4-like和Mss4/TCTP-associated超家族保守结构域以及TCTP_1和TCTP_2两个TCTP保守结构特征区;TaTCTP1与小麦受翻译调节的肿瘤蛋白TaTCTP序列(GenBank登录号为AAM34280)同源性高达98 %;亚细胞定位结果表明TaTCTP1编码一个胞浆蛋白;该基因的表达可能受到钙离子浓度的调控;该基因在小麦根、茎和叶中表达水平一致;TaTCTP1受小麦条锈菌诱导表达,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后12～48 h)高于亲和组合,于接种后18 h在非亲和组合中出现第一个表达高峰,而在侵染后期(接种后96～120 h),虽然非亲和组合中TaTCTP1出现第二个表达高峰,但在亲和组合中TaTCTP1有较高的相对表达量;TaTCTP1基因仅在乙烯、高盐和低温处理早期被诱导表达,对于其他激素包括水杨酸、茉莉酸等的处理,干旱和伤害处理后,其表达量基本无变化。利用BSMV-VIGS分析,TaTCTP1沉默后的水源11植株在挑战接种CYR23后,小麦叶片由原来的抗病反应型变为感病反应型,产生大量孢子;在挑战接种CYR31后,小麦叶片的症状与对照的反应型一致。以上结果表明,TaTCTP1可能通过乙烯信号途径参与对低温和高盐等逆境的抗性反应,并在小麦对条锈菌的抗病途径中发挥着十分重要的作用,这为进一步研究TaTCTP1在小麦与条锈菌互作中的特殊功能奠定基础。

【关键词】：小麦 小麦条锈菌 活性氧 防御基因 抗病相关基因 功能验证
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S435.121.42
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