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《西北农林科技大学》 2011年
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植物抗氧化活性成分检测新方法及杜仲抗氧化活性研究

张强  
【摘要】:人体内的氧化作用涉及多种人类疾病的发生,而食品中脂质的氧化会导致食品腐败变质,营养价值下降。抗氧化剂被大量使用以减弱人体内氧化压力和延长食品货架期。合成抗氧化剂长期被质疑可能对人体有害,近年使用天然抗氧化剂成为发展趋势。植物抗氧化活性影响因素众多,植物提取物中抗氧化活性化合物缺少快速检测方法,本文针对这两个问题进了相关研究。论文通过将不同类型高效液相色谱(简称HPLC,英文全称High Performance Liquid Chromatography)和不同类型自由基的检测系统(简称RSD,全称Radical Scavenger Detection)联用,建立了3种在线检测方法检测植物提取物中抗氧化活性化合物。首先建立了HPLC-RSD在线系统,继而以之为基础首次建立了自动富集HPLC-RSD在线系统,该系统增大了进样量,提高了系统灵敏度。论文又将galvinoxyl自由基引入在线系统检测方法,首次以正相HPLC为基础,建立了可快速检测脂溶性混合物中抗氧化成分的NP-HPLC-RSD在线检测系统。同时通过对杜仲体外抗氧化活性比较系统的研究,初步得到采收部位,采收时间,萃取部位,种植区域等因素对杜仲抗氧化活性的影响规律。应用所建立的三种在线检测系统检测了杜仲、果汁、水果、植物油和精油等不同类型的的植物提取物中的抗氧化活性化合物,同时利用HPLC-DAD-MS鉴定了几种抗氧化活性化合物的化学结构。研究结果如下。 1.以ABTS自由基为检测自由基,以RP-HPLC为基础,成功建立了HPLC-RSD在线检测系统,其自由基活性检测部分优化设置为:ABTS自由基浓度0.32 mmol/L,自由基溶液流速0.5 mL/min (HPLC流速为0.5 mL/min),反应圈长度10.0 m。系统对抗坏血酸等4种抗氧化剂最低检测浓度为0.12-0.37μmol/L,最低检测量为0.50~1.6 ng。 采用在线系统分析了一种混合果汁提取物及各萃取物,在叔丁基甲醚萃取物中发现其含有约20种抗氧化活性化合物。采用HPLC-DAD-MS技术分析了活性成分,初步鉴定出这种萃取物主要抗氧化活性成分为绿原酸及一种绿原酸类化合物,金丝桃苷和根皮苷也是其中的抗氧化活性成分。 利用此系统分析了杜仲叶和杜仲雄花样品。杜仲叶至少含有18种抗氧化成分,其最主要活性成分为绿原酸,一种槲皮素苷也是杜仲叶中的抗氧化成分。杜仲雄花至少含有19种抗氧化成分,其主要抗氧化活性成分同样是绿原酸,此外,杜仲树脂酚双葡萄糖苷也是雄花中的抗氧化成分。 HPLC-RSD系统使用简便,检测限较低,重现性好,可以快速检测混合物中的抗氧化活性化合物。 2.在上述HPLC-RSD在线系统基础上建立了自动富集HPLC-RSD在线系统,可增大进样量至200μL,有效提高了系统灵敏度,同一样品可检测到更多活性组分。系统对芦丁等3种抗氧化剂最低检测浓度为0.022~0.054μmol/L。 利用此系统分析了贮存时间,贮存温度和生产批次对一种混合果汁产品成分的影响。结果发现贮存9星期后,果汁产品已经发生明显变化,抗氧化成分含量减少,抗氧化活性降低。而冰箱冷藏和室温贮存在6星期内对果汁成分无显著影响。经过对不同批次产品的分析,区分了两种果汁产品。 利用自动富集HPLC-RSD在线系统分析了新鲜苹果汁、胡萝卜汁和草莓汁。发现苹果和草莓中抗氧化成分丰富。分析了不同温度处理一小时的苹果汁,结果发现超过60℃后,苹果汁中成分变化明显,抗氧化活性成分减少,有的活性成分消失。同时高温也生成了新的抗氧化成分。 自动富集HPLC-RSD在线系统,灵敏度更高,自动化程度高,可以用于食品,药材等提取物的抗氧化成分的检测。 3.建立了可快速检测脂溶性混合物中抗氧化成分的NP-HPLC-RSD在线检测系统。将正相HPLC引入在线检测方法并采用galvinoxyl自由基为检测自由基,因为该自由基比常用的DPPH自由基在弱极性溶剂系统中灵敏度更高,采用正己烷和叔丁基甲醚为HPLC洗脱溶剂,正己烷为自由基溶剂。在系统中使用超级缓冲器可显著减小系统噪音,增强信噪比。系统优化参数为:2μmol/L galvinoxyl自由基的正己烷溶液,由装有超级缓冲器的高压泵输送,流速为1.0 mL/min (HPLC流速1.0 mL/min),反应圈长度15m(反应时间24 sec)。对某些极性较强活性化合物,自由基溶液可以改用极性溶剂如甲醇等以降低检测限,加热反应圈也可以提高某些活性化合物灵敏度。 应用系统分析小麦胚芽油和橄榄油发现,植物油中主要的抗氧化成分为生育酚类。以HPLC-DAD-MS鉴定了小麦胚芽油中三种主要抗氧化成分分别为α-、β-、γ-生育酚。橄榄油中只发现α-生育酚。 应用系统分析迷迭香精油发现该精油中至少含有15种抗氧化活性组分。鉴定了其中3种活性组分分别为鼠尾草酸、鼠尾草酚和α-生育酚。 4.研究了杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)体外抗氧化活性,结果为:(1)杜仲皮、叶和雄花提取物均有较高抗氧化活性,其中以叶提取物抗氧化活性最高。(2)5月至10月采收杜仲叶中,8月杜仲叶DPPH自由基清除力、羟基自由基清除力、金属离子络合力和还原力以及总酚含量均较高,5月杜仲叶抗脂质过氧化活性较高。因此,5月和8月采收杜仲叶抗氧化活性较高。(3)在新疆、四川和陕西三地所产杜仲叶中,四川和陕西产杜仲叶DPPH自由基清除力、羟基自由基清除力、金属离子络合力和还原力以及总酚含量均高于新疆产杜仲叶,但是抗脂质过氧化活性略低于后者。(4)在杜仲叶水提物萃取物中,乙酸乙酯和正丁醇萃取物DPPH自由基清除力、羟基自由基清除力、金属离子还原力以及总酚含量和抗脂质过氧化活性均较高。乙酸乙酯和正丁醇可以有效富集杜仲叶中抗氧化活性化合物。(5)杜仲叶水提物抗氧化活性接近维生素C,其正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物活性显著高于维生素C,也高于商业抗氧化剂BHT。杜仲叶水提物具有抗氧化剂产业化潜力。(6)杜仲提取物中总酚含量与其抗氧化活性相关,在样品总酚含量接近时,相关性较低。 本论文建立的3种混合物中抗氧化物质在线检测方法快速,高效,简便,可以显著减少发现植物提取物中的抗氧化活性化合物所需要的时间以及消耗的人力和物力。系统可以用于发现新的抗氧化活性化合物,也可以用于监测食品和药材贮存、加工各环节中抗氧化活性化合物的变化。这种新方法将对天然抗氧化剂的研究和开发工作以及功能性食品的开发产生一定推动作用。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S567.19

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