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《西北农林科技大学》 2011年
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脂肪基质细胞分化为心肌细胞的研究

赵丽丽  
【摘要】:干细胞治疗在心血管疾病的临床应用研究中具有巨大的发展潜力。虽然一些体内和体外的实验结果令人振奋,然而,最佳干细胞来源以及干细胞成心肌细胞分化的分子机理仍有待进一步研究和证实。脂肪基质细胞(ADSCs)以其干细胞含量丰富、易采集、易培养、对供体损伤小、具备多谱系分化潜能和可自体移植等优势受到干细胞研究领域的广泛关注。虽然ADSCs可定向分化成心肌细胞的能力已被证实,但这一能力的验证目前仅限于兔、小鼠和人三个物种,而且对ADSCs成心肌细胞分化的机理也不甚清楚。 本研究以6-8周龄小鼠为实验动物,从腹股沟皮下脂肪组织中分离获得ADSCs,培养于仅添加青霉素、链霉素和20% NBS的DMEM培养液中观察其自发分化,采用流式细胞术分析ADSCs表面标记CD29、CD31、CD34和CD105的表达;细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色和流式细胞术分析α-actin、MF20、Connexin45、cMHC、cTnI、Nkx2.5和GATA4的表达;细胞免疫荧光染色和Ca2+成像分析验证ADSCs源心肌细胞E-C coupling的畅通;接着使用Touchdown-PCR方法克隆cardiacα-actin基因CDS序列,并构建其重组腺病毒表达载体(pAd- Nkx2.5),使用pAd-Nkx2.5和pAd-actin侵染原代培养的小鼠ADSCs,Real time-PCR和Western Blot检测超表达效果;并使用如上所述方法量化分析过表达前后心肌标志蛋白的变化,最后从整体上探讨过表达Nkx2.5和cardiacα-actin对小鼠ADSCs成心肌细胞分化的影响,主要研究结果如下: 1、原代小鼠ADSCs在体外培养条件下表达CD29和CD105,但不表达CD31和CD34,它们可在体外较低的培养条件下(DMEM+20% NBS,未添加任何细胞因子、5-azacytidine或抗氧化剂等)自发分化成心肌细胞,这些细胞可自发收缩,表达心肌标志蛋白α-actin、MF20、Connexin45、cMHC、cTnI、Nkx2.5和GATA4,收缩细胞中E-C coupling畅通并且表现出Ca2+瞬变的特性; 2、在ADSCs成心肌分化过程中过表达Nkx2.5和α-cardiac actin虽然增加了表达心肌标志蛋白(包括GATA4、cTnI、Connexin45和DHPR/RYR2)的表达,但减少了收缩心肌细胞数目,这可能与β-MHC蛋白表达的上调有关。 此外,本研究还以18日龄SD大鼠为实验动物,从腹股沟皮下脂肪组织中分离获得SVF,分别采用5-azacytidine和培养于半固体甲基纤维素培养基两种方法诱导ADSCs/SVF成心肌细胞分化,采用PCR分析心肌标志基因GATA4、MEF-2C、α- MHC、β-MHC、α-cardiac actin、cTnT和ANP的表达;细胞免疫化学染色、细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色和流式细胞术分析α-actin、MF20、Connexin45、cMHC、cTnI和Nkx2.5的表达;细胞免疫荧光染色和Ca2+成像分析验证SVF源心肌细胞E-C coupling的畅通;接着利用ROCK的特异性抑制剂Y-27632阻断Rho/ROCK通路,通过Actin-Tracker Green染色观察大鼠SVF细胞成心肌分化前后actin细胞骨架的变化;Western Blot分析调控细胞骨架改变的重要通路Rho/ROCK通路中关键激酶ROCK的表达,以及ROCK下游三条与细胞骨架相关通路(JNK、p38和Akt)的变化,最后从整体上探讨细胞骨架相关信号通路调控大鼠ADSCs成心肌细胞分化的机理,主要研究结果如下: 1、5-azacytidine可启动大鼠ADSCs成心肌分化的程序,诱导后的ADSCs表达部分心肌标志蛋白(Desmin、α-actinin、α-actin、MF20和Connexin45)并形成肌管样结构,但未见自发收缩; 2、大鼠SVF细胞在半固体甲基纤维素培养基中培养时可在体外分化为收缩的心肌细胞,这些收缩细胞表达心肌特异性mRNA(GATA4、MEF-2C、α- MHC、β-MHC、α-cardiac actin、cTnT和ANP)和蛋白(MF20、Connexin45、Nkx2.5、cTnI, cMHC和α-actin),并且表现出Ca2+瞬变的特性; 3、细胞骨架对大鼠SVF分化为心肌细胞的过程起着重要调控作用,抑制细胞骨架相关蛋白ROCK信号通路,减少了心肌标志蛋白的表达和跳动心肌细胞的形成,而后者可能是通过抑制JNKMAPK的磷酸化,以及促进p38MAPK和Akt磷酸化起作用的。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R329

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