TaMS-MADSbox和TaG3BP基因在小麦温敏雄性不育系育性转换中的功能分析
【摘要】：作物温光敏雄性不育系的利用为两系利用作物杂种优势提供了新的途径,然而,由于环境条件的复杂性,也加大了其生产利用的风险。揭示作物温光敏雄性不育系育性转换的分子基础,将为温光敏雄性不育系的合理高效利用提供理论基础,同时也为探索防控该类型不育系利用风险的措施,建立调控作物雄性不育育性转换的方法和技术奠定理论基础。YS型小麦温敏雄性不育系已应用于两系杂交小麦的选育,为了揭示YS型小麦温敏雄性不育系育性转换的分子基础,为其安全合理利用提供理论和技术,本研究对小麦TaMS-MADSbox和TaG3BP在YS型小麦温敏雄性不育系育性转换中的功能进行了较为深入的分析,旨在阐明其在该类型小麦温敏雄性不育系育性转换中的作用。
本研究选取YS型小麦温敏雄性不育系A3017不育和可育条件下小孢子各发育时期(减数分裂期、单核期、单～二核期、二核期及三核期)的花药和三种K型小麦细胞质雄性不育系及其保持系(K3314A/3314B、KTsp732A/Tsp732B和KTm3314A/Tm3314B)小孢子发育在单核～二核期的幼穗为主要材料,对TaMS-MADSbox和TaG3BP在YS型小麦温敏雄性不育系育性转换中的功能进行分析,获得的主要研究结果如下:
1 TaMS-MADSbox在育性转换中的功能分析
利用RACE技术从A3017中克隆了TaMS-MADSbox的1,131bp的全长cDNA序列(GenBank登录号:JN874386)。序列分析表明TaMS-MADSbox编码269个氨基酸,具有MADS-box转录因子典型的K-box结构域。该基因编码蛋白的pI/Mw为9.30/30.35。同源比对表明该基因与小麦MIKC-type MADS-box转录因子WM2及小麦MADS-box转录因子WAG高度同源。
采用Reverse transcription quantitative real-time PCR(RT-qPCR)技术对TaMS- MADSbox的表达模式分析表明,TaMS-MADSbox在A3017的育性转换关键时期(花粉发育的单核期～二核期)呈上调表达,且在不育条件下的表达量高于同时期可育条件下的表达量;TaMS-MADSbox在三种K型不育系幼穗中的表达量高于在其保持系中的表达量。表明该基因与小麦温敏雄性不育系的育性转换相关,该基因在育性转换关键时期的大量表达与其不育性密切相关。
采用BSMV-VIGS技术,在可育温度条件下,有效地沉默了TaMS-MADSbox在A3017穗部的表达。沉默植株出现部分花药瘦小、不开裂等不育性状,自交结实率降低。其中植株A3017-M-4自交结实率为0,表现完全雄性不育。RT-qPCR检测结果表明,随着该基因的沉默程度的加深,植株自交结实率也相应降低。综上分析表明,该基因的适量表达对小麦雄性不育系的育性非常关键,过高或过低的表达都会导致其雄性育性的降低。
2 TaG3BP在育性转换中的功能分析
采用RACE技术从A3017中克隆了TaG3BP的全长cDNA序列。序列分析表明该基因在A3017中存在1,311 bp和1,308 bp两个拷贝,分别命名为TaG3BP1和TaG3BP2(GenBank登录号:JF830798和JF830800),分别编码436或435个氨基酸。序列分析表明该基因具有Ras-GTPase激活蛋白(G3BP)的典型结构域NTF2和RRM。根据获得的全长cDNA序列设计引物,在A3017中分离了TaG3BP1和TaG3BP2的完整基因组DNA序列(GenBank登录号:JF830799和JF830801)。基因组DNA与cDNA序列的比对分析表明该基因两种拷贝中均含有9个外显子和8个内含子,同一拷贝的外显子与cDNA编码区完全重叠。两种拷贝间在内含子区域有较大的差异,编码区无明显差异。采用GenomeWalker技术在A3017中获得了该基因814bp的5′侧翼序列,分析表明该序列具有启动子的典型结构及多个顺式调控元件。进一步在上述三种K型不育系及其保持系中分离了该基因的全长cDNA、基因组DNA及5′侧翼序列。序列多重比对分析表明,在不同试验材料间该基因同一拷贝的序列存在多处单碱基差异,但对编码蛋白无显著影响。
RT-qPCR分析表明,TaG3BP在YS型小麦温敏雄性不育系A3017的育性转换关键时期(花粉发育的单核期～二核期)呈上调表达,且在可育条件下的表达量高于同时期不育条件下的表达量。该基因在三种K型不育系幼穗中的表达量低于在其保持系中的表达量。表明该基因与小麦温敏雄性不育系的育性转换相关,该基因在可育条件下的大量表达可能具有修复细胞质雄性不育系花药发育中的基因表达缺陷的作用,进而引起育性的恢复。
利用原核表达载体系统成功诱导了TaG3BP编码蛋白的表达,并制备了该蛋白的多克隆抗体Anti-TaG3BP。以Anti-Beta-Actin (Rabbit) (Biosynthesis, Beijing, China)为内参抗体,通过Western blot分析该基因编码蛋白的表达模式,结果表明在两种育性条件下,A3017小孢子各发育时期的花药中均检测到了约50-kDa的目标蛋白条带,TaG3BP的编码蛋白在可育条件下各时期花药中的表达量均高于同时期不育条件下的表达量,而且该基因的编码蛋白在A3017育性转换的关键时期(单～二核期)呈上调表达。
采用BSMV-VIGS技术,在可育条件下,使TaG3BP在YS型小麦温敏雄性不育系A3017的穗部表达得到了有效沉默。沉默植株出现部分花药瘦小,不开裂等不育性状,自交结实率降低。其中植株A3017-G-1自交结实率相对于对照植株显著降低。
综上分析表明,该基因的上调表达对小麦温敏雄性不育系的育性恢复有重要作用,TaG3BP可能是育性转换中的重要调控基因。这也是首次对植物中的G3BP基因的功能分析。
3小麦穗部BSMV-VIGS技术体系的初步建立
本研究中通过对植株叶片的持续侵染,在可育条件下,在YS型小麦温敏雄性不育系A3017穗部实现了TaMS-MADSbox及TaG3BP的有效沉默。不仅在叶片部位观察到病毒侵染的表型,而且RT-qPCR分析表明其在穗部花药中的表达明显降低。初步建立了在小麦穗部特异表达基因功能研究的BSMV-VIGS技术体系,拓宽了该技术在植物基因功能研究中的应用。
【关键词】：小麦 育性转换 TaMS-MADSbox TaG3BP 【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S512.1
【目录】：
- 摘要6-9
- ABSTRACT9-15
- 第一章 文献综述15-37
- 1.1 植物雄性不育及其机制研究15-17
- 1.1.1 细胞质雄性不育15-17
- 1.1.2 细胞核雄性不育17
- 1.2 小麦雄性不育及杂种优势利用17-20
- 1.2.1 小麦细胞质雄性不育系17-18
- 1.2.2 小麦核型雄性不育系18-19
- 1.2.3 小麦1B/1R 和非1B/1R 类型雄性不育系19-20
- 1.2.4 光温敏雄性不育小麦的研究20
- 1.3 光温敏雄性不育小麦育性转换的机制20-23
- 1.3.1 光温环境因子对育性转换的影响20-22
- 1.3.2 光温敏育性转换相关基因的分子机制22-23
- 1.4 植物基因功能分析的主要技术及其应用23-32
- 1.4.1 RACE 技术23
- 1.4.2 GenomeWalker 技术23
- 1.4.3 实时定量PCR23-25
- 1.4.4 基因体外表达25-26
- 1.4.5 转基因技术26-27
- 1.4.6 RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）27-28
- 1.4.7 病毒诱导的基因沉默技术28-30
- 1.4.8 生物信息学30-32
- 1.5 MADS-box 和G3BP 基因32-35
- 1.5.1 MADS-box 基因的研究32-34
- 1.5.2 G3BP 基因的研究34-35
- 1.6 本研究的目的意义及设想35-37
- 第二章 TaMS-MADSbox 基因的克隆、表达及功能分析37-68
- 2.1 材料37-39
- 2.1.1 材料和处理37-38
- 2.1.2 主要试剂38-39
- 2.1.3 载体和菌株39
- 2.2 试验方法39-50
- 2.2.1 RNA 的提取39
- 2.2.2 TaMS-MADSbox 基因cDNA 全长的克隆39-45
- 2.2.3 序列分析45
- 2.2.4 TaMS-MADSbox 基因的RT-qPCR 分析45-46
- 2.2.5 TaMS-MADSbox 基因的功能分析46-50
- 2.3 结果与分析50-65
- 2.3.1 小麦TCMS 系、K 型CMS 系及其保持系的育性分析50-52
- 2.3.2 RNA 质量分析52
- 2.3.3 TaMS-MADSbox 的cDNA 全长克隆52-58
- 2.3.4 TaMS-MADSbox 的表达模式分析58-60
- 2.3.5 TaMS-MADSbox 的功能分析60-65
- 2.4 讨论65-68
- 2.4.1 MADS-box 基因与植物花发育65-66
- 2.4.2 BSMV-VIGS 技术在小麦穗部基因沉默研究中的应用66-68
- 第三章 TaG3BP 基因的克隆、表达及功能分析68-97
- 3.1 材料68-69
- 3.1.1 材料和处理68
- 3.1.2 主要试剂68-69
- 3.1.3 载体和菌株69
- 3.2 试验方法69-76
- 3.2.1 RNA 及基因组DNA 的提取69
- 3.2.2 TaG3BP 全长cDNA 的克隆69
- 3.2.3 三种K 型细胞质雄性不育系及其保持系中TaG3BP 全长cDNA 的克隆69-71
- 3.2.4 TaG3BP 基因组序列的PCR 扩增71
- 3.2.5 TaG3BP 5′侧翼序列的扩增71
- 3.2.6 目的片段的回收、连接转化及阳性克隆筛选71
- 3.2.7 序列分析71
- 3.2.8 TaG3BP 的原核表达分析71-74
- 3.2.9 TaG3BP 的抗体制备74-75
- 3.2.10 TaG3BP 的Western blot 分析75-76
- 3.2.11 TaG3BP 的RT-qPCR 分析76
- 3.2.12 TaG3BP 基因的功能分析76
- 3.3 结果与分析76-94
- 3.3.1 TaG3BP 基因cDNA 全长序列的获得及结构域分析76-78
- 3.3.2 TaG3BP 基因组全长序列的获得及序列分析78
- 3.3.3 系统进化分析78-80
- 3.3.4 TaG3BP 启动子序列分析80-82
- 3.3.5 TaG3BP 的原核表达分析82-85
- 3.3.6 TaG3BP 的Western blot 分析85-86
- 3.3.7 TaG3BP 的表达模式分析86-88
- 3.3.8 CMS 系及其保持系中TaG3BP 的序列比对分析88-90
- 3.3.9 TaG3BP 的功能分析90-94
- 3.4 讨论94-97
- 3.4.1 细胞质雄性不育（CMS）的机理94-95
- 3.4.2 G3BP 与温敏雄性不育的育性恢复95-97
- 第四章 结论97-99
- 参考文献99-111
- 缩写目录111-112
- 附录1 实验所用试剂配制方法112-115
- 附录2 实验所用仪器115-116
- 致谢116-117
- 作者简介117
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