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《西北农林科技大学》 2012年
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禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆表达及ELISA检测方法的初步建立

郝华芳  
【摘要】:禽脑脊髓炎(avian encephalomyelitis, AE)是由禽脑脊髓炎病毒(avianencephalomyelitis virus,AEV)引起的以侵害雏鸡中枢神经系统为主的传染病。该病于1930年在美国首次发现,20世纪80年代初传至我国,随后在广东、河南、河北、内蒙古等地造成流行。陕西省自1997年报道AE以来,近年来疫情有上升的趋势。AE主要引起雏鸡发生运动失调和头颈部的快速震颤等症状,病死率为10%~70%;产蛋鸡感染后主要表现为产蛋突然下降,降幅为16%~43%,给养禽业造成了很大危害。市场上出售IDEXX公司的AEV抗体检测试剂盒,其价格昂贵,不适合我国基层的大批量检测;国内虽有研究但没有商品化试剂盒在市场上供应。因此寻求特异性强、灵敏度高、简单快速、适合于大批样品检测的方法势在必行。本研究从临床疑似AE的发病鸡群中分离到一株禽脑脊髓炎病毒(YL株),对AEV陕西分离株SX和YL株的VP1基因进行了克隆与分析,对SX株的VP1蛋白进行表达,以纯化的蛋白作为抗原初步建立了AEV抗体的ELISA检测方法。主要获得以下结果: 1.从陕西杨凌地区的临床疑似禽脑脊髓炎的发病鸡群中分离到1株病毒,通过琼脂扩散试验、人工感染试验等鉴定,初步判定所分离的病毒株(YL)为禽脑脊髓炎病毒。根据GenBank中发表的AEV VP1基因序列,设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AEV SX株和YL株的VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定,然后与已知的AEV毒株序列进行比较,应用DNAStar生物软件对其进行分析。结果表明,AEV SX株和YL株的VP1基因全长均为810bp,编码270个氨基酸残基;两毒株与参考毒株VP1基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为88.5%~99.8%和89.3%~99.4%,两毒株仅存在部分碱基的突变,没有缺失和插入;系统进化树结果表明SX株、YL株均与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近,与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远。 2.将AEV SX株的VP1基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达质粒pET32a-VP1,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,优化表达条件,经His亲和层析柱纯化。酶切鉴定及基因测序结果表明VP1基因成功连入表达载体中;VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,确定的pET32a-VP1最佳诱导温度为37℃,最佳的IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,最佳诱导时间是5h,SDS-PAGE结果可见分子量约为50ku的融合蛋白。Western blot结果分析,融合蛋白能够和AEV阳性血清发生特异的反应,且具有很好的反应原性。按确定好的条件大量诱导重组蛋白,经His亲和层析柱纯化得到380μg/mL的目的蛋白。 3.以纯化的VP1融合蛋白作为抗原包被ELISA酶标板,建立AEV抗体的间接ELISA检测方法,并对反应的条件进行优化。结果通过筛选确定的最优ELISA工作条件为:重组抗原的包被浓度3.8μg/mL,37℃2h后4℃过夜包被,封闭液选择1%的BSA,封闭条件为37℃2h,待检血清的稀释倍数为1:50,37℃孵育0.5h,酶标抗体的最佳稀释倍数为1:4000,最佳工作条件为37℃作用30min,底物的显色选择为37℃5min。在此基础上对24份阴性血清进行测定,确定的临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率达到91.9%。该方法可用于临床样品的大批量检测。 综上所述,AEV SX株、YL株的VP1基因均与1143株、L2Z株的亲缘关系较近,与其他已知毒株亲缘关系较远,表明SX株、YL株与已知AEV毒株在进化方面存在一定程度的差异;AEV SX株VP1基因在原核表达系统中获得了高效表达,产物为50ku的可溶性融合蛋白,表达蛋白具有很好的反应活性;将纯化的蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于临床样品的大批量检测。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.659.6

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