Cdh1基因在牛卵母细胞GVBD中的功能研究

【摘要】：在哺乳动物卵母细胞减数分裂GV期阻滞和减数分裂恢复过程中，MPF（CDK1-Cyclin B1）活性的变化起着关键性作用。有报道表明Cdh1基因在小鼠卵母细胞GV期阻滞过程中发挥重要的作用，APCCdh1通过降解Cyclin B1，防止其在生发泡中积累，从而使CDK1处于失活状态，将卵母细胞阻滞在GV期。本研究对Cdh1基因在牛卵母细胞GVBD中的功能进行了研究。 本研究首先从牛颗粒细胞中克隆了Cdh1基因并构建了pVenus-Cdh1重组质粒；其次对Roscovitine（ROS）抑制后的牛卵母细胞GVBD进程的变化进行了研究；最后，通过向牛卵母细胞中显微注射Cdh1-Venus cRNA，对Cdh1蛋白在牛卵母细胞中的定位情况进行了观察，并研究了超表达Cdh1基因对牛卵母细胞GVBD的影响。 研究取得以下结果： 1.利用RT-PCR技术成功地从牛颗粒细胞中克隆得到Cdh1基因的CDS全长序列，经与NCBI上公布的Cdh1序列进行比对，同源性为100%。将其连接到pVenus真核表达载体上成功构建了pVenus-Cdh1重组质粒。 2.将牛卵母细胞在含有50μM ROS的成熟培养液中培养14h，然后移入不含ROS的成熟培养液中，分别在之后的0h、1h、2h、3h和4h将卵母细胞固定。对照组卵母细胞在不含ROS的成熟培养液中培养，分别在0h、2h、4h、6h和8h将卵母细胞固定。对卵母细胞进行染色，然后判定卵母细胞所处的时期，并统计GVBD发生率。结果发现与对照组相比，ROS抑制后的牛卵母细胞GVBD进程缩短了大约4h。 3.向ROS抑制的牛卵母细胞中显微注射Cdh1-Venus cRNA，对不同时期牛卵母细胞中Cdh1-Venus蛋白的定位情况进行了观察。结果显示，在GV期牛卵母细胞中，Cdh1-Venus蛋白主要分布于生发泡中，GVBD发生后，Cdh1-Venus蛋白主要分布在染色体和纺锤体所在的区域。 4.向对照组和实验组的牛卵母细胞中分别注射Venus cRNA和Cdh1-Venus cRNA，分别在移除ROS后的1h、2h和3h将卵母细胞固定并染色，后然判定卵母细胞所处的时期并统计GV期卵母细胞的比例。结果显示，实验组中GV期卵母细胞的比例均高于对照组，并且在2h和3h时分别存在显著性差异，说明在牛卵母细胞中超表达Cdh1基因延迟了GVBD的发生。 本研究得到如下结论：ROS抑制后的牛卵母细胞GVBD进程缩短了大约4h；在GV期牛卵母细胞中，Cdh1蛋白主要分布于生发泡中，GVBD发生后，Cdh1蛋白主要分布于染色体和纺锤体所在的区域；在牛卵母细胞中超表达Cdh1基因延迟了GVBD的发生。