秦川牛胰岛素诱导基因的克隆、组织表达及遗传变异分析

【摘要】：胰岛素诱导诱导基因（Insulin induced gene INSIG）包括INSIG1基因和INSIG2基因两个成员，参与机体脂质代谢，抑制胆固醇合成，同时也参与能量平衡和体重的调节。本试验以INSIG1基因和INSIG2基因为候选基因，以秦川牛为研究对象，采用RT-PCR法成功克隆了秦川牛生长和胴体性状候选基因INSIG2，并对其进行了生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR技术研究了秦川牛INSIG1基因和INSIG2基因在不同组织中的表达规律；采用PCR-RFLP、PCR-SSCP技术和DNA测序技术相结合，研究了秦川牛INSIG1基因和INSIG2基因在秦川牛群体中的遗传多样性及其与生长和胴体性状的相关性，主要结果如下： 1.秦川牛INSIG2基因的克隆及生物信息学分析 分别以三头20±2月龄的秦川牛肝脏组织为材料，成功克隆得到秦川牛INSIG2基因完整编码区序列，大小为362bp，提交GenBank获得登录号JQ951942，该片段开放阅读框包括351个核苷酸，共编码116个氨基酸，对INSIG2基因编码蛋白质的生物信息学分析发现该蛋白相对分子质量12.8kD，等电点为7.73；INSIG2蛋白蛋白质疏水性预测结果显示疏水值最大为2.444，位于第54和第55个氨基酸处，疏水值最小为-1.533，位于第40个氨基酸处；跨膜结构预测显示该蛋白可能有三个由内向外的跨膜螺旋，分别位于第22~39aa处、45~65aa处和76~97aa处；在该蛋白第16、44和第78个氨基酸处，可能有三个蛋白质磷酸化位点；信号肽区域预测发现该蛋白没有信号肽锚定位点； 2.秦川牛INSIG1、INSIG2基因组织表达规律 采用用实时荧光定量技术研究了3头20±2月龄秦川牛INSIG1基因和INSIG2基因在肝脏、肺脏、脾脏、瘤胃、心脏、腹脂、肌肉以及小肠8个组织中的相对表达量。结果发现：秦川牛INSIG1基因在肝脏中高度表达，在其他7个组织中表达量很低；秦川牛INSIG2基因在8个组织中均有表达，在肝脏中表达量最高，其次是在肺脏中，在其他6个组织中表达量较少。 3.秦川牛INSIG1基因多态性及其与生长和胴体性状的关联分析 利用DNA测序技术和PCR-RFLP技术研究了215头20±2月龄秦川牛INSIG1基因多态性及其与生长和胴体性状的关联分析，发现了INSIG1基因A4366G、T4534C、T5001C和A5235G四个突变位点，遗传多样性分析结果表明四个位点均为中度多态位点；分别研究了各位点与秦川牛生长和胴体性状的相关性，从研究结果可以看出，部分基因型个体在生产性能方面要优于其他基因型个体，在A4366G位点，GG型个体腰角宽和胴体重显著高于AA型个体（P0.05），而GG型个体宰前活重极显著高于AA型个体（P0.01），不同基因型之间体高和体长间差异不显著；在T4534C位点，CC型个体体长和腰角宽显著高于TT型个体（P0.05），而CC型个体和TC型个体在体高方面极显著高于TT型个体（P0.01），；在T5001C位点，CC型个体体长显著高于TT型个体（P0.05），在体高、宰前活重、胴体重和腰角宽方面，各基因型之间差异不显著。在A5235G位点，各基因型之间生长和胴体性状无显著差异，总体上来说，AA型个体在各个性状上要优于AG型个体和GG型个体（P0.05）。 4.秦川牛INSIG2基因多态性及其与生长和胴体性状的关联分析 利用DNA测序技术和PCR-SSCP技术研究了215头20±2月龄秦川牛INSIG2基因多态性及其与秦川牛肉质和胴体性状的关联分析，发现了秦川牛INSIG2基因T15570C突变位点，遗传多样性分析结果表明该位点为中度多态位点；关联分析结果显示TT型个体体高显著高于TC型个体（P0.05），TT型为优势基因型个体，在其他性状上不同基因型与生产性状之间无显著相关（P0.05）。 本研究成功克隆获得秦川牛INSIG2基因完整编码区序列并对其进行了生物信息学分析，为进一步研究INSIG2基因在秦川牛生长发育过程中的作用奠定了理论基础。并对INSIG1基因和INSIG2基因在秦川牛不同组织中的表达规律进行了研究，为进一步研究相关性状的表达提供了科学依据。对秦川牛INSIG1基因和INSIG2基因SNP位点进行检测，并对其与生长和胴体性状的相关性进行了研究，部分位点发现了显著相关，为进一步开展秦川牛本品种选育工作提供了理论依据。