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《西北农林科技大学》 2012年
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中国野生葡萄芪合成酶和病程相关蛋白PR10基因克隆与功能分析

贺明阳  
【摘要】:葡萄(Vitis spp.)是世界性重要经济作物之一,受葡萄白粉菌和霜霉菌等危害严重。葡萄白藜芦醇是一种植保素,在植物对病原菌的防御反应中起重要作用,同时对人体健康具有消炎、抗癌、预防心脑血管疾病等作用。芪合成酶是葡萄催化合成白藜芦醇的关键酶。植物病程相关蛋白PR10受病原菌诱导积累,参与葡萄抗真菌病害反应。本研究克隆了野生毛葡萄(V. quinquangularis)抗白粉菌和果实高含白藜芦醇株系‘丹凤-2’芪合成酶基因和野生华东葡萄(V. pseudoreticulata)抗白粉菌和霜霉菌株系‘白河-35-1’的PR10基因,并对其进行了表达和功能研究。主要取得以下结果: 1.以中国野生华东葡萄芪合成酶基因序列在Genoscope葡萄基因组数据库搜索,共获得53条芪合成酶基因同源序列,其中9条序列无芪合成酶特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’,而具有查尔酮聚合酶家族特征识别序列‘GVLFGFGPGLT’,推测为查尔酮合成酶基因序列。欧洲葡萄(V. vinifera)芪合成酶基因家族有44条芪合成酶基因成员,在第10染色体上有6条,第16染色体上有38条,其中11条不能正确编码芪合成酶。通过RACE技术克隆获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’果实和接种白粉菌叶片芪合成酶基因家族成员41条,其中一条编码区有缺失;将其登录GenBank,登录号为:JQ868658至JQ868698。欧洲葡萄和野生毛葡萄芪合成酶基因序列种内保守,但种间进化关系较远。 2.通过实时定量PCR分析,芪合成酶基因在葡萄根中表达量最高,在叶片中表达量最低;在果实发育过程中,芪合成酶基因在转色期出现表达高峰,在果实成熟期,野生毛葡萄芪合成酶基因出现表达高峰,而欧洲葡萄果实转色期后开始持续下降;野生毛葡萄芪合成酶基因和苯丙烷类代谢途径的相关基因的表达模式与欧洲葡萄相关基因表达模式不同;野生毛葡萄STS基因和PAL基因在果实成熟期的表达高峰和白藜芦醇在成熟果实的积累趋势一致。野生毛葡萄白藜芦醇在果实发育不同阶段的模式与欧洲葡萄果实白藜芦醇积累模式相似,在转色期达到最高峰,分别为16.897μg·FW-1和8.908μg·FW-1,随后开始下降;野生毛葡萄果实白藜芦醇在果实成熟期有一个积累峰,而欧洲葡萄果实白藜芦醇含量持续降低。野生毛葡萄成熟果实中白藜芦醇在果实含量高于欧洲葡萄‘黑比诺’成熟果实中白藜芦醇含量,野生毛葡萄成熟果实白藜芦醇含量为7.297μg·gFW-1,欧洲葡萄成熟果实白藜芦醇含量为4.791μg·gFW~(-1)。 3.通过实时定量PCR分析,野生华东葡萄、野生毛葡萄和欧洲葡萄芪合成酶基因受葡萄白粉菌和霜霉菌诱导调控;表达水平与葡萄种质对病原菌的抗性呈正相关;野生毛葡萄和欧洲葡萄各芪合成酶基因家族成员受白粉菌诱导表达模式不相同,各芪合成酶基因成员的表达模式和水平都有差异。野生毛葡萄芪合成酶基因受亲和的葡萄白粉菌和不亲和的烟草白粉菌诱导表达,参与葡萄亲和性抗病和非亲和性抗病;芪合成酶基因受脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、冷、热和干旱等非生物胁迫调控表达;受水杨酸诱导表达量最高。在葡萄叶片接种白粉菌后,芪合成酶基因与病程相关蛋白基因PR1、PR2、PR10和PR14协同表达,芪合成酶基因表达变化最大。 4.以芪合成酶多克隆抗体分别免疫白粉菌和霜霉菌接种的葡萄叶片,葡萄芪合成酶定位于接种病菌叶片表皮细胞的细胞质、细胞壁和霜霉菌的菌丝和吸器细胞壁;构建野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS1原核表达载体,将芪合成酶基因在大肠杆菌中融合表达,葡萄芪合成酶融合蛋白对葡萄白粉菌、霜霉菌、灰霉菌和烟草赤星病有体外抑菌活性;构建野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS1的植物表达载体pCAMBIA1302-VqSTS1,在烟草中过量表达葡萄芪合成酶基因,能诱导烟草病程相关蛋白基因PR1、PR2、PR4高水平积累,PR5和PR10少量上调表达,而烟草查尔酮合成酶基因被抑制表达。结果表明芪合成酶可能通过芪合成酶及其产物白藜芦醇的直接抑菌活性和调控病程相关蛋白基因表达等多途径增加植物抗病性。 5. PR10.2基因在野生华东葡萄和欧洲葡萄叶片中的表达水平高于其他PR10基因家族成员。通过RACE技术克隆获得野生华东葡萄抗白粉菌和霜霉病株系‘白河-35-1’病程相关蛋白PR10.2基因,命名为VpPR10.2,GenBank登录号为:HQ634186。通过PCR扩增,克隆获得VpPR10.2基因gDNA序列和启动子序列,GenBank登录号为:HQ634185。VpPR10.2与欧洲葡萄VvPR10.2基因编码区序列同源率为99.6%,推导氨基酸序列同源率为100%,启动子区域同源率为96.2%。欧洲葡萄PR10基因家族启动子区域序列同源性低,可能是PR10基因家族成员表达模式差异的原因。 6.通过实时定量PCR分析,VpPR10.2在根、茎、叶、花和果实中表达,在根中表达水平最高,在叶中最低;VpPR10.2受葡萄白粉菌、霜霉菌诱导表达;VpPR10.2受白粉菌诱导后表达峰出现在12dpi,而欧洲葡萄VvPR10.2出现在72hpi;VpPR10.2受霜霉菌诱导后在72dpi出现表达高峰,约为接种前表达水平的13倍左右,而欧洲葡萄VvPR10.2先受抑制表达而后少量上升表达。VpPR10.2受ABA、MeJA和SA诱导表达,ABA诱导量最大;VpPR10.2受冷、热和干旱胁迫诱导表达。结果表明,VpPR10.2受生物和非生物胁迫诱导表达,在抗、感病葡萄种质中受病原菌诱导表达模式有差异。 7.构建VpPR10.2原核表达载体pGEX-VpPR10.2,将VpPR10.2在大肠杆菌中融合表达,纯化获得VpPR10.2融合蛋白。VpPR10.2融合蛋白能降解酵母总RNA和葡萄gDNA,具有体外RNase和DNase活性;VpPR10.2融合蛋白具有体外抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)生长功能;构建VpPR10.2基因的植物表达载体pCAMBIA1302-VpPR10.2,冻融法转入农杆菌中。通过真空渗透法将VpPR10.2转入欧洲葡萄中,在叶片中过量表达VpPR10.2基因能提高欧洲葡萄叶片对霜霉菌的抗性;VpPR10.2蛋白在叶片中动态定位于细胞壁、细胞质、叶绿体和细胞核;受霜霉菌诱导后能进入霜霉菌吸器细胞的胞质和葡萄叶片表皮细胞的细胞核,诱导葡萄叶片表皮细胞程序性死亡。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S663.1

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【引证文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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