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《西北农林科技大学》 2012年
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PiggyBac转座子介导的转E.coli半胱氨酸合成酶基因绒山羊研究

白丁平  
【摘要】:我国是世界上最大羊绒生产国,所产山羊绒在国际上享有“软黄金”的盛誉。但是,不断提高绒山羊的产绒量、改善绒山羊的羊绒品质,一直是人们的努力方向。目前,应用转基因技术是提高绒山羊产绒量和羊绒品质的重要手段之一。半胱氨酸是山羊绒的主要成分,通过转基因技术,借助piggyBac转座子向绒山羊体内导入半胱氨酸合成基因有助于提高羊绒产量,改善羊绒品质,从而为培育高产绒绒山羊新品种奠定理论基础。本研究的对象、技术、方法、研究目的及结果如下: 1.提取大肠杆菌基因组DNA,克隆获得半胱氨酸合成酶基因cysE(serineacetyltransferase,丝氨酸乙酰基转移酶)、cysM(O-acetylserine sulfhydrylase,氧-乙酰丝氨酸巯解酶)完整序列。其中cysE序列全长822bp,对应编码274个氨基酸;cysM序列全长912bp,对应编码304个氨基酸。之后,构建原核表达载体pET-cysE和pET-cysM并在大肠杆菌BL21(DE3)进行了cysE和cysM蛋白表达,建立了cysE和cysM基因原核表达系统。 2.采用基因克隆等分子生物学技术构建了分别包含cysE和cysM基因的红色、绿色荧光蛋白真核表达载体pIRES2-Red2-cysE和pIRES2-EGFP-cysM。利用脂质体LipofectamineTM2000共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得共表达外源基因cysE和cysM的转基因细胞,随后,通过核移植注射获得了同时携带cysE和cysM基因的绒山羊重构胚。 3.为了研究piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点,构建了pB-CMV-EGFP-NEO转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。同时,提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测了piggyBac转座子的整合位点。结果显示在绒山羊基因组中有21个piggyBac转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧正向的5个碱基组成中,piggyBac转座子3′端倾向于插入到富含AT(58.35%)碱基区域,piggyBac转座子5′端倾向于插入到富含GC(57.8%)碱基区域。本研究获得的整合位点信息可为进一步利用piggyBac转座子开展转基因绒山羊研究提供理论参考。 4.参照绵羊瘤胃特异表达基因小脯氨酸丰富蛋白II(PRD-SPRRII)序列,设计特异引物,克隆获得了绒山羊PRD-SPRRII启动子区序列3400bp。通过密码子优化,合成了更适合在绒山羊体内表达的cysE和cysM基因新序列。之后,成功构建了包含密码子优化后的cysE和cysM基因的绒山羊瘤胃特异表达piggyBac转座子主载体,即pB-EGFP-NEO-CMV-PRD-cysE-cysM。 5.用piggyBac转座子主载体pB-EGFP-NEO-CMV-PRD-cysE-cysM单独转染和与辅助载体pcDNA-Trans共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得了不同转染方式下的转基因细胞。经实时荧光定量PCR检测发现,piggyBac介导的外源基因EGFP和cysM表达水平分别比对照组提高了7.78倍和6.23倍,表明piggyBac转座子在绒山羊基因组中具有高效转座活性。利用Splinkerette PCR在绒山羊基因组中获得了29个整合位点。分析整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成发现,piggyBac转座子倾向于插入到绒山羊基因组富含AT(67.95%)碱基区域。 6.利用piggyBac转座子介导成功获得一只体内携带E.coli半胱氨酸合成酶基因cysE和cysM的转基因陕北白绒山羊个体。Splinkerette PCR检测获得了23个piggyBac转座子在转基因绒山羊基因组中的整合位点,发现piggyBac转座子倾向于整合到转基因绒山羊基因组富含AT(62.70%)碱基区域。 以上结果表明,piggyBac转座子可实现胎儿成纤维细胞高效转座和外源基因高效表达,从而为生产piggyBac转座子介导转E.coli半胱氨酸合成酶基因的高产绒绒山羊新品种奠定了前期研究基础。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S827

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【参考文献】
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