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《西北农林科技大学》 2013年
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产乌头碱内生真菌的分离、鉴定及固体培养基的优化

杨凯  
【摘要】:研究表明,植物内生真菌能够产生具有多种生物活性的代谢产物,同时也可以产生与宿主相同或结构类似的成分。乌头碱是常用的中药乌头和附子中的主要有效成分,具有良好的抗炎镇痛作用,临床用于治疗风湿、类风湿性关节炎,同时也表现出抗肿瘤的活性;乌头碱可致使实验动物心律失常,因此可以作为一种工具服务于基础试验的研究。目前,乌头碱主要从乌头属植物中提取,含量低、工艺复杂和不易纯化。本试验以白喉乌头根部样品为植物材料,分离和鉴定产乌头碱的内生真菌,为开发乌头碱来源提供更多新的候选资源;为了适应工业化生产,对产乌头碱内生真菌进行固体优化培养,以提高乌头碱产量。试验取得以下成果: 1.通过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对新疆白喉乌头根部样品中分离出的22株内生真菌进行筛选,发现其中一株编号为XJ-AC03的内生真菌可以产生乌头碱,含量为236.4μg/g (乌头碱/菌丝干重);并通过质谱(MS)、核磁共振(NMR)方法进一步检测,结果表明内生真菌XJ-AC03菌丝中的乌头碱与乌头碱标准品的化学结构相一致。 2.根据菌落形态及显微形态的观察结果,将菌株XJ-AC03初步鉴定为枝孢菌Cladosporium cladosporioides。在此基础上,对其ITS片段进行扩增,得到长度为552bp的DNA片段,在NCBI数据库中进行ITS序列同源性比对,XJ-AC03的ITS序列和NCBI中收录的Cladosporium sp.LH-CAF5(HQ717404) ITS序列同源性为99%,结合形态学特征和分子生物学鉴定结果将菌株XJ-AC03鉴定为枝孢菌Cladosporium cladosporioides。 3.在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman试验设计法,对影响菌株XJ-AC03产乌头碱的查氏培养基中的6个培养基成分进行了筛选,确定影响该菌株产乌头碱的主要成分为蔗糖、硝酸钠和氯化钾。在此基础上,通过最陡爬坡试验、中心组合试验和响应面分析法对其3个显著因素的最佳水平范围进行研究,优化后最佳培养基组成为(g/L):蔗糖34.44,硝酸钠5.12,KCl0.97,MgSO_4·7H_2O0.5,FeSO40.01,K_2HPO_41;此时菌株XJ-AC03乌头碱的含量为377.48μg/g,与优化前的试验中乌头碱含量236.4μg/g相比提高了59.68%。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q946

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