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黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定

厉秀秀  
【摘要】:黄连(Coptis chinensis Franch)作为我国传统的常用中药材之一,能清热、泻火、燥湿、解毒,其主要成分小檗碱具有抗微生物、抗心律失常、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等药理作用。但黄连生长周期长、产量低;同时受到盲目开采,大部分野生黄连处于濒危或渐危状态;其主要成分小檗碱的化学合成方法尚不成熟,细胞工程方法生产小檗碱尚未有报道,因此人们试图通过其他途径获得黄连的有效成分小檗碱。近年来的研究表明,植物内生真菌能产生与宿主植物相同或相似的代谢产物,因此,植物内生真菌成为人们筛选新型活性物质的微生物来源。本研究以黄连为研究对象,采用组织块法对黄连中的内生真菌进行分离,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠埃希菌(Escherichia coli)为指示菌,用琼脂块法对分离的内生真菌进行抑菌活性试验,初步筛选出具有抑菌作用的菌株,经摇瓶发酵培养后,用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)检测其代谢产物中的小檗碱,并对其产量进行分析,采用形态学和分子生物学相结合的方法对产小檗碱内生真菌进行鉴定,为发酵生产小檗碱及黄连的综合开发奠定了基础。 主要结果如下: 1.从黄连中共分离到10株内生真菌,以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为指示菌,用琼脂块法对分离获得的内生真菌进行抑菌活性试验,结果表明,有4株真菌(HL-A,BC,C,D)对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性,而对大肠埃希菌的抑菌作用不明显。 2. TLC和HPLC检测有抑菌活性的内生真菌代谢产物中的小檗碱并对其产量进行分析。TLC检测结果表明,4株有抑菌活性的内生真菌发酵液供试品均出现与盐酸小檗碱标准品颜色和Rf值相同的斑点,HPLC检测结果表明,供试品的保留时间与标准品的相同,判断菌株发酵液中含有小檗碱,并测得4株内生真菌HL-A,BC,C,D的产量分别为1.83mg/L,0.63mg/L,1.19mg/L,1.28mg/L。 3.根据内生真菌菌株HL-A,BC,D的形态学特征,结合分子生物学鉴定结果,将HL-A,BC,D确定为拟星衣属(Arthopyreniaceae),拟茎点霉属(Phomopsis)和拟隐孢壳属(Cryptosporiopsis),菌株HL-C与所选的菌株同源性均较高,无法将其分开,因此结合其形态学特征暂将其定为Neonectria radicicola,尚需进一步研究。


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