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《西北农林科技大学》 2014年
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小麦TaMCA4和SNAREs基因的克隆及其在小麦抗条锈病过程中的作用研究

王逍冬  
【摘要】:由小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麦条锈病是小麦作物上的一种真菌病害,对我国小麦生产造成威胁。小麦抗条锈品种的培育与种植是防治条锈病最经济、有效和安全的策略。而克隆小麦抗条锈病通路中的抗病相关基因,并对其基因功能进行研究与注释,可为小麦抗条锈品种选育和遗传改良提供理论基础。本研究结合生物信息学分析、荧光实时定量qRT-PCR、基因枪轰击瞬时转化、病毒介导的基因沉默VIGS技术、酵母双杂交技术、双分子荧光互补BiFC技术、免疫胶体金蛋白超微结构定位等分子生物学技术,成功对小麦细胞程序性死亡相关半胱氨酸蛋白酶TaMCA4以及囊泡转运相关蛋白SNARE在抗小麦条锈菌过程中进行了功能研究。研究的主要内容和结果如下: 1.细胞程序性死亡(PCD)是生物体去除多余或者有害细胞的一系列生理反应。细胞程序性死亡广泛参与到多细胞组织的形成以及限制病原菌扩展的过敏性坏死反应中。半胱氨酸蛋白酶作为一种靶标降解半胱氨酸位点的蛋白酶类,在细胞程序性死亡过程中起关键作用。本研究成功从小麦品种“水源11”中克隆得到小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaMCA4。该半胱氨酸蛋白酶属于二型半胱氨酸蛋白酶,并具有C14半胱天冬肽酶结构域及两亚结构之间的较长连接区域等典型特征。利用基因枪介导的基因瞬时转化体系在烟草叶片中瞬时表达TaMCA4基因并不能直接诱导产生细胞程序性死亡反应,但可以显著增强由小鼠细胞坏死诱导因子Bax及来自小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的效应子产生的坏死反应。坏死反应增强现象同样可见于基因枪介导的小麦叶片基因瞬时表达体系。荧光实时定量qRT-PCR结果表明TaMCA4基因的表达水平在接种小麦条锈菌弱毒性小种“条中23”的小麦叶片中显著提高,而在接种强毒性小种“条中32”的小麦叶片中无明显变化。利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)抑制TaMCA4基因表达后,小麦品种“水源11”的条锈菌感病性显著增强且侵染部位的坏死面积减小。 2.可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)的亚细胞定位以及它们形成复合体的能力,决定了囊泡融合过程中的特异性。NPSN11作为植物特有的SNARE基因(NPSN)家族的一员,此前被报道参与细胞有丝分裂新生细胞板形成过程中的细胞壁前体转运过程中。然而,NPSN基因亚家族在植物病原物互作过程中的作用仍不明确。本研究从小麦中成功克隆了三个NPSN基因(TaNPSN11、TaNPSN12和TaNPSN13)和三个植物抗病相关SNARE基因(TaSYP132、TaSNAP34和TaMEMB12)。酵母双杂交及双分子荧光互补(BiFC)实验发现其中的两个SNARE蛋白TaSYP132与TaNPSN11存在特异性蛋白互作,而该互作可能表明这两个蛋白协同参与某些囊泡转运过程。借助荧光实时定量qRT-PCR技术,在接种小麦条锈菌的(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)小麦叶片中,三个TaNPSNs和TaSYP132的基因表达水平受到的诱导程度不同。利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术,在TaNPSN11、TaNPSN13和TaSYP132的基因沉默植株中,小麦品种“兴资9104”的抗条锈菌非亲和小种“条中23”的抗病性减弱,而TaNPSN12的基因沉默植株抗病性未发生变化,表明这些小麦SNARE同源基因在小麦细胞阻止条锈菌侵染和菌丝延伸方面存在不同功能。免疫胶体金实验表明TaNPSN11蛋白或其结构类似蛋白主要分布在靠近条锈菌菌丝方向的细胞膜附近的囊泡状结构处。以上实验结果表明TaNPSN11在囊泡介导的小麦抗条锈菌抗病过程中起关键作用。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S512.1

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【共引文献】
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