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《西北农林科技大学》 2016年
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Desmodium incanum根化感物质黄酮碳苷的生物合成与相关糖基转移酶底物专一性研究

郝冰  
【摘要】:独脚金属Striga hermonthica寄生杂草对撒哈拉以南非洲的农作物造成了严重的危害,使玉米、高粱和水稻等粮食作物大面积减产。Rothamsted research和International Centre of Insect Physiology and Ecology(icipe)合作推广的“Push–Pull technology”在防治独脚金属寄生杂草的过程中,采用间作山蚂蝗属植物(Desmodium spp.)的方法有效的抑制寄生杂草的生长。抗旱品种Desmodium.incanum根系分泌物中包含的具有化感作用的黄酮类化合物可以保护农作物免受独脚金属(Striga spp.)寄生杂草的侵害,其中几种含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的黄酮双碳苷类化合物为主要化感成分。本课题组之前的研究证实,异夏佛塔苷(isoschaftoside)可以有效抑制寄生杂草种子胚芽生长,且在田间试验中,无寄生杂草生长的迹象。本研究通过对包括异夏佛塔苷在内的5个黄酮双碳苷类和2个黄酮碳苷类化合物在D.incanum中的生物合成途径及相关糖基转移酶的底物专一性进行了以下研究:通过对D.incanum根系分泌物进行分析,确定了其所包含的5个黄酮双碳苷化合物的化学结构。采用同位素标记的2-羟基柚皮素作为第一步糖基化反应的底物,尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)为糖基供体,在D.incanum叶片和跟组织糖基转移酶(CGTs)的催化下合成了两种天然黄酮碳苷类化合物:牡荆苷和异牡荆苷。又以水稻糖基转移酶(OsCGT)合成的2-羟基柚皮素葡萄糖苷中间体为第二步糖基化反应底物,尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose)和尿苷二磷酸阿拉伯糖(UDP-arabinose)分别为糖基供体在D.incanum CGTs的催化下合成了5个天然的黄酮双碳苷化合物。同时,通过使用同位素标记的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-α-D-[UL-13C6]glucose)和同位素标记的尿苷二磷酸半乳糖(UDP-α-D-[UL-13C6]galactose)排除了粗酶溶液中尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶(UDP-glucose-4-epimerase)对糖基供体确定带来的干扰,明确了D.incanum根系分泌物中5个天然的黄酮双碳苷的生物合成途径。同时,本研究在确定2-羟基柚皮素为OsCGT和D.incanum CGTs底物的基础上,设计并合成了6个天然黄酮类底物和17个新的底物衍生物,通过研究23个2-羟基柚皮素衍生物与OsCGT的酶促反应活性,确定了OsCGT与黄酮类底物结合位点以及对不同底物的专一性程度。通过测试D.incanum CGTs对23个底物衍生物的催化能力,确定底物与两种CGTs的结合位点相同。且与OsCGT相比较,D.incanum CGTs对底物的专一性更弱,可以与B环带有更大基团的底物进行反应。通过使用2-羟基柚皮素葡萄糖苷衍生物中间体作为底物,尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose)和尿苷二磷酸阿拉伯糖(UDP-arabinose)分别为糖基供体,研究了在第二步糖基化反应中D.incanum CGTs与糖基化底物的反应活性,并判断出D.incanum叶片及根部粗酶中可能含有至少2种CGTs分别负责不同底物的糖基化反应。山蚂蝗属植物D.incanum中黄酮双碳苷生物合成途径的确定,为D.incanum CGTs的分离纯化、基因型的的确定,以及研究具有抗寄生杂草的转基因作物提供的理论基础。也为主要依赖除草剂抗寄生杂草的治理现状提供了一种天然绿色的治理方法。与黄酮碳苷类化合物的化学合成相比,由CGTs催化的黄酮碳苷生物合成方法避免了羟基保护难,产物产率低等问题,并具有反应条件温和、绿色高效等特点。通过本研究对两种CGTs底物专一性的程度进行分析,为合成不同结构的黄酮碳苷类化合物提供了一种新的思路。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q946

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