利用酵母重组技术提高作物秸秆乙醇发酵的研究

【摘要】：我国是农作物种植大国,每年产生的农作物秸秆和其它农作物废弃物高达7亿吨以上。而种类多、数量巨大的农作物秸秆尚未进行大规模有效的开发利用,甚至被焚烧造成严重环境污染。利用这些丰富廉价的农作物秸秆可以代替粮食生产非粮燃料乙醇,其中甜高粱(Sorghum bicolor(L)Moench)是最有发展潜力的能源作物。甜高粱种质资源丰富,种植范围广,抗逆境能力强,茎秆产量高,茎汁含糖量高,同时也是生物量最高的作物之一。甜高粱作为生物质能源有很好的发展前景,其秸秆榨汁含糖量高,其榨汁和渣都可以生产乙醇。利用其秸秆渣水解物中的木糖发酵为乙醇才能提高作物秸秆纤维素乙醇的生产效益,同时降低农民的种植成本,构建高效代谢木糖的酿酒酵母(Sacc-haromyces cerevisiae)菌株,利用甜高粱等作物秸秆发酵燃料乙醇能缓解能源危机和保护环境。本研究以甜高粱秸秆为原材料,构建酿酒酵母工程菌,以甜高粱茎秆榨汁及渣混合原料进行同步糖化乙醇发酵并进行条件优化,提高甜高粱秸秆乙醇产量,为作物秸秆综合利用提供模式。1.对酿酒酵母T1308进行遗传背景分析,其5.8S rDNA-ITS序列与数据库中酿酒酵母序列同源性100%,确定该出发菌株为酵母;其子囊孢子美蓝染色及对MAT基因座序列分析,确定酵母为是杂合型二倍体(aα)。通过同源重组敲除其尿嘧啶合成酶关键基因URA3,获得尿嘧啶营养缺陷型菌株T1308-U。2.利用粳稻及真菌木糖异构酶基因构建木糖异构酶表达载体在酿酒酵母里获得表达,分析重组菌株木糖异构酶酶活,确定真菌木糖异构酶基因更适合在酵母里表达及其启动子。重组菌株木糖利用率分别是出发菌株的1.78-1.99倍,乙醇产率可达0.31g/g消耗糖。3.构建具有抗性标记kanMX和尿嘧啶合成酶基因URA3不同筛选标记的两种强启动子TPI的载体,并将启动子直接插入酿酒酵母的木酮糖激酶基因及非氧化磷酸戊糖途径(PPP)关键基因之前,再转入粳稻或真菌的木糖异构酶表达载体,获得的木糖代谢流增强的重组菌株,与出发菌株相比,重组菌株PXI-T1308-U转录水平上木酮糖激酶表达增强了4.08倍,磷酸戊糖途径非氧化阶段的磷酸戊酮糖差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、转醛酶、转酮酶表达分别增强了4.17、17.36、1.62和3.98倍。木糖利用率比出发菌株提高了3.28倍,乙醇产率达到0.33g/g消耗糖。4.以甜高粱秸秆为原料,对其茎秆榨汁及渣同步糖化乙醇发酵工艺进行优化,按最优发酵条件,重组菌株发酵的乙醇浓度达到31.79g/L,这比单纯以甜高粱茎汁为原料发酵所得乙醇浓度提高了5.45g/L。本研究首次以甜高粱茎秆榨汁和渣为原料,并利用基因重组酵母厌氧条件下进行同步糖化乙醇发酵,并对甜高粱茎秆渣汁同步糖化发酵工艺进行优化。选择粳稻木糖异构酶基因及重组酵母构建等方面的研究具有应用前景,相关结果为促进甜高粱等能源作物的转化利用缓解能源危机及降低秸秆燃料乙醇的生产成本提供参考。