一株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因的遗传进化分析

【摘要】：伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV;Aujeszky’disease virus,ADV),属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)α-疱疹病毒亚科,PRV可感染多种家畜及野生动物,其中猪最易感,也最为严重,是该病毒的自然宿主和贮存者。PRV可造成严重的经济损失,被我国列为2类传染病。当前,国内使用的PRV疫苗有猪伪狂犬弱毒疫苗、野毒灭活苗和基因工程缺失疫苗。疫苗的广泛使用有效地控制了PR的流行,部分国家依靠疫苗已经逐渐消灭了PR,我国也在2010年前基本控制了PR。但自2011年以来,童光志、田志军、李学伍和陈焕春等相继报道了在吉林、黑龙江、河南和山东等多个省份免疫猪群暴发PR的病例。发病猪场公猪出现体温升高、阴囊炎,母猪屡配不孕或者配种后产弱仔、死胎或流产,仔猪腹泻、伴发神经症状和高死亡率。张青占、赵鸿远和潘宵等分别从河南、黑龙江、江苏和吉林等多个省份发病的免疫猪场中分离到PRV,且实验证明部分分离株为变异PRV强毒株,表明现有疫苗不能完全保护免疫猪群,仍有暴发PR疫情的可能。近几年,陕西省猪群PR发生的频率呈上升趋势,为分析陕西省猪群PR的流行情况,本研究对陕西省12家规模化猪场进行了采样和PRV检测,并对其中某疑似发生PR的猪场进行了实验室诊断和病毒分离鉴定及遗传进化分析,研究内容和结果如下:1.陕西省规模化猪场PRV感染状况的调查。选取陕西省具有地域代表性的12个PR免疫过的猪场,随机采取经产母猪血样,分离血清,共获得血清样品78份,使用PCR和ELISA PRV-g E抗体检测方法对血清样品进行检测。结果显示,4个猪场PRV PCR检测阳性,占抽检猪场的33.33%;14份血清PRV PCR检测阳性,占检测样品数的17.95%;5个猪场PRV g E抗体阳性,占抽检猪场的41.46%;17份血清PRV g E抗体阳性,占检测样品数的21.79%。2.发病场猪PR的诊断及PRV的分离鉴定。2015年10月陕西某猪场暴发疑似PR的疫情,采取发病仔猪的血液、脑、脊髓、肝脏和脾脏,通过ELISA、PCR、动物试验等对病例进行实验室诊断,最终确定为PRV感染。将病料处理后接种BHK-21细胞进行PRV分离,经连续6次传代,细胞出现病变规律稳定,获得效价稳定的病毒,测定TCID50为10-5.386/0.1m L。通过PCR检测、家兔接种、鸡胚接种等试验对病毒进行了进一步鉴定,鉴定为PRV,将其命名为SX-10-2015。3.PRV SX-10-2015株g E基因的扩增与序列分析。为进一步研究PRV陕西分离株SX-10-2015的遗传进化地位,对分离株g E基因进行了扩增和测序,将获得的g E基因序列与近些年来流行的PRV毒株、本实验室2006年分离的WG株、以及国内外经典PRV毒株的g E基因序列进行了同源性比对分析,并构建了遗传进化树。结果发现分离株SX-10-2015与国内近年的PRV流行毒株GD-4-2013株、JN和WZ株遗传距离较近,属同一分支;与国外Kaplan、Ni A3和00V7分离株遗传距离较远,属于不同分支;分离毒株SX-10-2015的g E基因编码氨基酸同源性分析显示与GD-4-2013分离株和He N1分离株同源性分别为99.7%和99.3%;而其与Ea和FA PR疫苗株g E氨基酸同源性分别为99.3%、98.8%和98.8%。以上研究结果提示,陕西省规模化猪场PRV阳性率和猪个体PRV阳性率均较高;分离的SX-10-2015株g E毒力基因核苷酸和氨基酸序列与近年报道的变异株同源性较高,遗传进化地位更近,但其氨基酸同源性与国内疫苗毒株Ea和FA同源性也高达98.8%,疫苗免疫能否为SX-10-2015株提供免疫保护仍需进一步研究。