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《西北农林科技大学》 2017年
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猪瘟病毒细胞入侵途径及GBF1和Rab2调控其增殖的研究

梁武龙  
【摘要】:猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种烈性传染病,对养猪业危害很大,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病之一,我国将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒(CSFV)为黄病毒科瘟病毒属成员,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。国内外对CSFV的致病机理开展了一系列研究,取得了一些进展,但对CSFV的扩散方式、细胞入侵途径及复制机制等尚不完全清楚。因此,本研究以CSFV感染猪睾丸细胞(Swine testis cell,ST)为模型,针对CSFV在体外培养系统中的传播方式、入侵易感细胞的途径及复制增殖与高尔基体-内质网反式运输调节蛋白GBF1和Rab2的关系开展了研究,获得以下研究结果:1.CSFV随着细胞分裂增殖,低浓度中和抗体不能完全阻断病毒的传播。通过低熔点琼脂糖及中和抗体阻断试验,证明CSFV在体外培养系统中以释放后再感染的方式扩散,未能发现CSFV细胞间直接传播的证据;通过检测不同浓度中和抗体对CSFV扩散限制效果发现,抗体浓度低于1×105ND50时不能阻断CSFV的扩散;通过分析在中和压力下CSFV感染斑块阳性细胞数和细胞倍增时间得知,CSFV能够随着细胞的分裂而增殖。2.CSFV利用网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。用real-time PCR和间接免疫荧光法检测CSFV早期入侵细胞的情况,发现在CSFV感染过程中添加网格蛋白组装抑制剂氯丙嗪和动力蛋白抑制剂dynasore后,细胞内CSFV含量显著下降;通过shRNA干扰载体的构建和细胞转染、筛选,成功构建了网格蛋白重链和Ⅱ型动力蛋白干扰细胞株,通过对比检测CSFV入侵干扰细胞的效率发现,在网格蛋白重链和Ⅱ型动力蛋白表达量下调后,CSFV感染早期胞内CSFV含量显著减少,证明CSFV能够通过网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。3.CSFV入侵细胞依赖初级内体和次级内体。利用氯化铵调节CSFV感染过程中细胞的酸性,通过检测感染早期胞内CSFV含量,发现氯化铵抑制了CSFV入侵细胞的效率,证明CSFV感染需要酸性环境诱导;构建了初级内体标志蛋白Rab5和次级内体标志蛋白Rab7和Rab9的shRNA载体,并通过转染ST细胞和嘌呤霉素筛选得到了干扰细胞株;通过对比检测感染早期CSFV在Rab5、Rab7和Rab9干扰细胞和ST细胞及随机干扰细胞中的含量,证明Rab5、Rab7和Rab9基因下调后CSFV入侵细胞的效率显著下降,说明CSFV入侵细胞对初级内体和次级内体有着依赖性。4.GBF1和Rab2调控CSFV的增殖。利用布雷菲德菌素A和golgicide A抑制GBF1活性,通过real-time PCR和病毒滴度检测发现,CSFV的增殖对GBF1抑制剂较为敏感;通过shRNA干扰得到GBF1、ARF1和Rab2干扰细胞,并对CSFV在此3种细胞及对照细胞上增殖的情况进行检测,结果发现,GBF1和Rab2表达量下调后CSFV的增殖受到了明显抑制,而CSFV在ARF1干扰细胞上的增殖情况与对照组没有显著差异,过表达GBF1和Rab2能够促进CSFV增殖。试验结果表明高尔基体-内质网反式运输调节蛋白GBF1和Rab2能够调控CSFV的增殖,而CSFV增殖并不依赖ARF1蛋白。综上所述,本研究明确了在体外培养系统中CSFV的传播方式、对易感细胞的入侵方式及其依赖的亚细胞结构和蛋白,证明了高尔基体-内质网逆向转运调控蛋白GBF1和Rab2在CSFV增殖中发挥了重要作用,为全面了解CSFV生命周期及复制机制提供了新的理论资料和数据支持。
【关键词】:猪瘟病毒 细胞入侵 网格蛋白 内体 GBF1 Rab2
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-13
  • 文献综述13-36
  • 第一章 哺乳动物病毒非经典传播方式的研究进展13-24
  • 1.1 病毒在细胞间的传播13-21
  • 1.1.1 病毒自由扩散传播的条件及可能存在的屏障13-14
  • 1.1.2 病毒胞外自由扩散和胞间传播的利与弊14
  • 1.1.3 能够通过细胞间传播方式扩散的病毒的特征14-15
  • 1.1.4 病毒细胞间传播的机制15-16
  • 1.1.5 通过细胞间传播的病毒及其传播机制16-21
  • 1.2 外泌体依赖的病毒传播21-22
  • 1.2.1 外泌体概述21-22
  • 1.2.2 外泌体调控RNA病毒传播22
  • 1.3 展望22-24
  • 第二章 病毒通过内吞方式入侵细胞的研究进展24-36
  • 2.1 内吞途径为病毒感染提供便利24
  • 2.2 病毒内吞需要受体的介导24-25
  • 2.3 病毒内化所依赖的内吞途径25-30
  • 2.3.1 网格蛋白介导的内吞途径26
  • 2.3.2 网格蛋白和小窝非依赖的内吞途径26-27
  • 2.3.3 小窝依赖的内吞途径27-28
  • 2.3.4 病毒触发的大胞饮途径28
  • 2.3.5 其他途径28-30
  • 2.4 囊膜病毒膜突破机制30-35
  • 2.4.1 囊膜病毒膜融合概述30-31
  • 2.4.2 囊膜病毒膜融合诱导机制31-35
  • 2.5 展望35-36
  • 试验研究36-95
  • 第三章 猪瘟病毒体外培养系统中传播方式的研究36-50
  • 3.1 材料36-37
  • 3.1.1 病毒、细胞和主要试剂36-37
  • 3.1.2 主要仪器设备37
  • 3.2 方法37-39
  • 3.2.1 细胞培养与传代37
  • 3.2.2 细胞总RNA提取、cDNA合成及real-time PCR37-38
  • 3.2.3 间接免疫荧光试验38
  • 3.2.4 病毒滴度检测38-39
  • 3.2.5 低熔点琼脂糖扩散限制试验39
  • 3.2.6 抗体扩散限制试验39
  • 3.2.7 数据分析39
  • 3.3 结果39-47
  • 3.3.1 CSFV间接免疫荧光法的建立39-40
  • 3.3.2 CSFV在ST细胞上增殖的检测40-41
  • 3.3.3 低熔点琼脂糖限制CSFV在体外培养系统中的传播41-44
  • 3.3.4 中和抗体对CSFV在体外培养系统中的限制作用44
  • 3.3.5 CSFV增殖与细胞增殖的关系44-47
  • 3.4 讨论47-49
  • 3.5 小结49-50
  • 第四章 猪瘟病毒通过网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞50-65
  • 4.1 材料50-51
  • 4.1.1 病毒、细胞和主要试剂50-51
  • 4.1.2 主要仪器设备51
  • 4.2 方法51-54
  • 4.2.1 抑制剂细胞安全浓度检测51
  • 4.2.2 病毒入侵细胞的抑制剂干扰试验51-52
  • 4.2.3 细胞总RNA提取、cDNA合成及real-time PCR52
  • 4.2.4 干扰载体的构建52-53
  • 4.2.5 细胞转染和阳性细胞筛选53
  • 4.2.6 间接免疫荧光试验53
  • 4.2.7 数据分析53-54
  • 4.3 结果54-62
  • 4.3.1 抑制剂CPZ和dynasore在ST细胞上安全浓度的检测54
  • 4.3.2 网格蛋白组装抑制剂CPZ对CSFV入侵ST细胞的抑制效果检测54-57
  • 4.3.3 动力蛋白抑制剂dynasore对CSFV入侵ST细胞的抑制效果检测57-59
  • 4.3.4 网格蛋白重链和动力蛋白2型shRNA干扰细胞的建立和检测59-60
  • 4.3.5 CSFV在CHC和dynamin-2干扰细胞上的入侵检测60-62
  • 4.4 讨论62-64
  • 4.5 小结64-65
  • 第五章 猪瘟病毒入侵对内体依赖性的研究65-76
  • 5.1 材料65
  • 5.2 方法65-67
  • 5.2.1 NH_4Cl抑制试验65-66
  • 5.2.2 Real-time PCR66
  • 5.2.3 干扰载体的构建和细胞转染66-67
  • 5.2.4 间接免疫荧光试验(IFA)67
  • 5.2.5 数据分析67
  • 5.3 结果67-73
  • 5.3.1 CSFV感染ST细胞依赖于酸性环境诱导67-68
  • 5.3.2 Rab5基因干扰细胞的构建及鉴定68-69
  • 5.3.3 Rab5基因下调抑制CSFV感染ST细胞69-70
  • 5.3.4 Rab7基因干扰细胞的构建及鉴定70-71
  • 5.3.5 Rab7基因下调抑制CSFV对ST的细胞的侵染71-72
  • 5.3.6 Rab9基因干扰细胞的构建及鉴定72-73
  • 5.3.7 CSFV感染ST细胞依赖于Rab973
  • 5.4 讨论73-75
  • 5.5 小结75-76
  • 第六章 GBF1和Rab2对猪瘟病毒复制的影响76-95
  • 6.1 材料76-77
  • 6.2 方法77-79
  • 6.2.1 抑制剂病毒增殖干扰试验77
  • 6.2.2 Real-time PCR77-78
  • 6.2.3 干扰载体的构建和细胞转染78
  • 6.2.4 间接免疫荧光试验78
  • 6.2.5 病毒滴度检测78-79
  • 6.2.6 Western blot79
  • 6.2.7 慢病毒表达载体的构建及病毒包装79
  • 6.2.8 数据分析79
  • 6.3 结果79-92
  • 6.3.1 BFA能够抑制CSFV增殖79-81
  • 6.3.2 CSFV增殖对GCA敏感81
  • 6.3.3 GBF1表达量下调抑制CSFV的增殖81-85
  • 6.3.4 Rab2表达量下调抑制CFSV的增殖85-88
  • 6.3.5 CSFV增殖不依赖于ARF188-90
  • 6.3.6 过表达GBF1和Rab2促进CSFV增殖90-92
  • 6.4 讨论92-94
  • 6.5 小结94-95
  • 结论95
  • 本论文的创新点95
  • 有待进一步研究的问题95-96
  • 参考文献96-115
  • 主要缩略词和中英文对照表115-117
  • 致谢117-118
  • 作者简介118-119

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