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《西北农林科技大学》 2017年
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梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶活性、表达量及与生长发育的关系研究

赵爱平  
【摘要】:梨小食心虫Grapholitha molesta是一种世界性果树重要害虫,主要危害桃梢及桃、梨、苹果等果实,其典型的季节性转移寄主危害习性是引起梨小食心虫常年猖獗成灾的主要原因。昆虫中肠胰蛋白酶在昆虫取食消化和生长发育中起着重要作用。本研究以梨小食心虫为研究对象,首先运用生化技术测定了梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶的最适pH。在此基础上,一方面用不同寄主植物饲喂梨小食心虫,观察其生长发育状况,同时测定胰蛋白酶的活性,初步探明胰蛋白酶的活性在昆虫生长发育中的作用及寄主适应性。另一方面运用分子生物学技术克隆中肠胰蛋白酶基因,获得其序列相关生物学信息,并通过实时荧光定量PCR技术测定其在取食不同寄主植物的梨小食心虫体内表达量,初步明确胰蛋白酶在昆虫消化过程中的分子调控机制,为以昆虫中肠蛋白酶为靶标的害虫防治提供新思路。取得的具体研究结果如下:(1)运用生化技术获得在Tris-HCl,KH2PO4/NaOH和Glycine/NaOH 3种缓冲液中,梨小食心虫幼虫中肠总蛋白酶最适pH分别为10.5、11.0和11.0,强碱性胰蛋白酶的最适pH分别为10.5、11.0和11.0,弱碱性胰蛋白酶的最适pH分别为8.5、9.0和9.0。(2)收集从田间采集到的桃梢、梨、木瓜、苹果(秦冠)4种寄主植物和人工饲料饲养的虫源取食苹果(秦冠)、苹果(嘎啦)、海棠、毛桃、油桃、李6种寄主果实的梨小食心虫不同龄期幼虫,发现其中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶活性存在差异显著。从田间4种寄主植物上采集到的梨小食心虫中肠3种蛋白酶活性均表现为4龄3龄5龄,其中从寄主梨上采集的梨小食心虫3种蛋白酶活性最高,其次为木瓜。室内人工饲料饲养的梨小食心虫取食6种不同寄主,其总蛋白酶活性在4龄差异显著;强碱性胰蛋白酶活性差异显著,活性表现为4龄3龄5龄;弱碱性胰蛋白酶活性无差异。室内人工饲料饲养的梨小食心虫取食苹果(秦冠)的总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶活性大于取食苹果(嘎啦)的活性。从田间寄主苹果(秦冠)上采集的梨小食心虫总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶活性小于用人工饲养的梨小食心虫取食苹果(秦冠)寄主的活性。(3)室内观察人工饲养的梨小食心虫取食苹果(秦冠)、苹果(嘎啦)、海棠、毛桃、油桃、李6种寄主果实及从田间寄主苹果(秦冠)上采集梨小食心虫取食苹果(秦冠)的生长发育及繁殖状况,发现其在不同寄主植物间存在显著性差异。人工饲养的梨小食心虫取食毛桃,其幼虫期(9.79 d)、成虫期(11.16 d)、幼虫-成虫总历期(29.09 d)、幼虫存活率(38.66%)、羽化率(68.86%)、产卵量(50.0粒)和蛹重(8.96 mg)都比较低,但内禀增长率rm较大;取食寄主苹果(秦冠)的梨小食心虫的化蛹率(98.13%)和单雌产卵量(67.8粒)大于取食寄主苹果(嘎啦);取食寄主李的梨小食心虫的单雌产卵量(110.6粒)最高;取食寄主苹果的单雌产卵量高于取食桃果。李是梨小食心虫最适宜的寄主。(4)利用分子生物学技术克隆出GMtrypsin-1与GMtrypsin-2两个梨小食心虫幼虫中肠胰蛋白酶基因,其长度分别为861 bp和923 bp,分别编码257和259个氨基酸,预测分子量分别为27.98 kDa和27.93 kDa。氨基酸序列分析表明2个基因翻译出的蛋白均含信号肽、催化三联体His-Asp-Ser以及末端高度保守区RIVGG和GDSGGP,这些结构与胰蛋白酶所具有的特征一致。氨基酸序列同源性比对分析发现基因GMtrypsin-1与大豆食心虫Leguminivora glycinivorella的亲缘关系较近,而基因GMtrypsin-2与其它鳞翅目昆虫亲缘关系相对较远。(5)实时荧光定量PCR技术检测发现梨小食心虫幼虫中肠内胰蛋白酶基因GMtrypsin-1与GMtrypsin-2在取食不同寄主的梨小食心虫体内表达量存在显著差异。在4龄时的表达量3龄5龄。从田间寄主苹果(秦冠)上采集梨小食心虫的GMtrypsin-1表达量高于人工饲料饲养梨小食心虫取食苹果(秦冠),而GMtrypsin-2表达量低于后者。人工饲料饲养梨小食心虫取食苹果(秦冠),其2个基因的表达量均低于取食苹果(嘎啦)。从田间寄主桃树梢上采集的梨小食心虫、人工饲料饲养取食苹果(嘎啦)和油桃的梨小食心虫幼虫,2个基因的表达量都较高。(6)综合分析表明:胰蛋白酶活性影响梨小食心虫历期、蛹重、羽化率及产卵量等参数,促进梨小食心虫的生长发育。梨小食心虫中肠蛋白酶活性和胰蛋白酶基因表达量均表现为4龄3龄5龄。人工饲养的梨小食心虫取食寄主李的GMtrypsin-2表达量最高,蛋白酶活性高且生长发育良好,三者之间呈正相关,但也存在个别特殊现象,说明胰蛋白酶活性、表达量在不同寄主上和同一寄主不同品种间存在差异,这些差异与梨小食心虫的生长发育相关。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S433

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