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《西北农林科技大学》 2017年
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家蚕Dorsal的表达纯化及激活研究

彭亚纯  
【摘要】:家蚕是重要的经济昆虫,在养殖过程中容易受到病原微生物的感染引发蚕病,给桑蚕业带来巨大的经济损失,因此,家蚕抗病等免疫机制的深入研究非常迫切。家蚕依赖其先天免疫系统抵抗病原微生物的侵染,抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)的产生是家蚕的主要免疫应答反应。抗菌肽主要由IMD(immune deficiency)途径和Toll途径产生,Rel/NF-κB是两种途径中的转录因子,作为关键调节子来调节免疫相关基因。在果蝇体内,作用于Toll途径的Rel/NF-κB转录因子Dorsal被真菌和革兰氏阳性菌激活。Dorsal在细胞质内与Cactus相互作用,当受到免疫刺激时,Dorsal与Cactus分离进入细胞核,进而产生抗菌肽。在家蚕体内,目前没有直接证据证明Dorsal作用于Toll途径,在受到病原菌感染后是否从细胞质进入细胞核还不清楚。本研究中我们以家蚕为模式生物,克隆Dorsal基因,构建原核表达菌株并表达、纯化Dorsal蛋白,制备家蚕Dorsal抗体。我们选取了革兰氏阳性菌黑胸败血菌Bacillus bombysepticus和革兰氏阴性菌假结核耶尔森氏菌Yersinia pseudotuberculosis、大肠杆菌Escherichia coli分别注射感染家蚕,取感染后12h、24h脂肪体细胞进行核质蛋白提取,分别检测细胞核、细胞质中Dorsal蛋白的含量变化及蛋白分子量,通过其含量变化和分子量的变化推测Dorsal的激活、转运。我们选取了革兰氏阳性菌黑胸败血菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌注射感染家蚕,检测Attactin2,CercropinE,Lebocin,Gloverin3,Moricin五种抗菌肽表达量的变化是否与Dorsal蛋白的变化一致。结果如下:(1)利用大肠杆菌表达家蚕Dorsal蛋白,获得家蚕Dorsal抗体。(2)提取感染后的家蚕脂肪体细胞核质蛋白,用Dorsal抗体检测核质内Dorsal蛋白,发现感染12h时,Dorsal蛋白可能以二聚体形式存在于细胞质中,在细胞核中并未检测到Dorsal蛋白;24h时,细胞质中Dorsal被激活,在蛋白水平发生改变,并且在受到细菌感染后部分活化的Dorsal蛋白由细胞质转运后进入细胞核,感染革兰氏阳性菌后转运效果更明显。(3)利用实时定量PCR检测发现,家蚕在感染黑胸败血菌和大肠杆菌后,Attactin2,CercropinE,Lebocin,Gloverin3,Moricin在家蚕脂肪体中的表达水平均有显著上升,说明家蚕感染病原菌后会激活抗菌肽的表达。结果表明:家蚕感染细菌24h后激活Dorsal蛋白,Dorsal在蛋白水平发生变化,并且部分蛋白从细胞质转运进入细胞核,且革兰氏阳性菌的激活作用较革兰氏阴性菌更明显。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S884

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