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《西北农林科技大学》 2017年
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藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究

辛海云  
【摘要】:抗生素的发明和使用,对人类和动物疾病防控发挥了极其重要的作用,但其广泛而超标应用导致了抗药菌株的产生,给人类和动物的健康造成极大的威胁。因而,研究和筛选抗生素的替代品成为国内外生命科学研究的热点。在众多研究中发现,抗菌肽具有广谱抗菌活性,对各种有害微生物、真菌、病毒的危害和肿瘤细胞的产生等均有很好的防控效果,而且很少产生耐药性,因而受到国内外研究者的高度青睐。藏猪又称为藏香猪,是我国青藏高原上常年放牧生长的宝贵地方品种,在长期严酷的自然环境条件下,形成了珍贵的抗寒、抗病、食草、肉香等优良特性,这些宝贵的优良特性必然与其肠道特殊的微生物区系有关,其肠道中存在的多种大量微生物群落相互拮抗又相互促进共生,为藏猪肠道提供了优良的微生态环境,分泌的各种维生素及多肽、蛋白等,发挥了促进健康和预防疾病的功能,同时,也为拮抗菌和抗菌物质的筛选提供了来源。基于此,我们以藏猪肠道微生物为研究对象,采取多种现代先进的生物技术,研究藏猪肠道内容物中是否存在拮抗病原菌的微生物,以及能否从筛选的拮抗菌中分离出有效的抑菌物质,如抗菌肽等。通过以下系列研究,获得如下试验结果:1、采用琼脂扩散法从藏猪的盲肠内容物中筛选出一株拮抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性最强的细菌,经过对该菌株进行菌落观察、美蓝染色鉴定以及16S rDNA的比对和系统发育进化树分析,判定该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus sublitis TS;发酵条件优化分析表明,最佳碳源为2%的玉米粉,最佳发酵起始pH值为6,最佳培养温度为30℃,接种后发酵至24h时其抑菌活性最高,抑菌物质的产量最高。检测发现,该菌发酵上清液具有不耐热、不耐蛋白酶K的特点,而且在中性环境下,抑菌活性最高。2、采用AKTA蛋白纯化系统及反相液相色谱系统,利用不同规格的反相液相色谱柱,包括ResourceTM RPC(3 mL)、Ultisil XB-C8、ZORBAX 300SB-C18色谱柱,结合超滤浓缩装置,逐步将分离筛选的拮抗菌种Bacillus sublitis TS发酵产生的抑菌活性物质进行分离纯化,得到了一种新型的天然抗菌肽TP(Tibetan-swine derived peptide)。其质谱分析表明,该纯化抗菌肽包含16个氨基酸,序列为ASVVNKLTGGVAGLLK,分子质量为1568.919 Da。在APD数据库中没有发现与其相同的氨基酸序列,因此命名为新型抗菌肽TP,在线预测显示其带有两个正电荷,疏水性氨基酸比例为50%,等电点为10,分子式为C68H124N18O20S0。另外,TP的二级结构预测结果各异,可能形成螺旋结构,疏水氨基酸和亲水氨基酸分别分布在螺旋结构的两面,也可能形成无规则卷曲结构,其确定的结构形式仍需做进一步的验证。3、采用MH琼脂平板法,研究了抗菌肽TP对多种G+和G-细菌的抑制效果,结果以最小抑菌浓度(MIC)表示。研究结果表明,TP的敏感菌株多为革兰氏阴性菌,阳性菌的敏感性较弱。以E.coli ATCC 25922为模型,探究了抗菌肽TP对细菌生长抑制的动态作用效果。在一定范围内,其作用时间越久,浓度越高,抑制效果越好,但对抑制大肠杆菌的传统多肽多粘菌素相比活性仍然较弱。TP处理E.coli ATCC 25922后发现:(1)在扫描电镜下观察,细胞表面完整性受到破坏;(2)邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)可以摄入细胞内,产生邻-硝基苯酚(ONP),表明TP可以增强E.coli ATCC 25922的细胞膜渗透性;(3)渗出细胞外的K+浓度增加,进一步证明了其渗透性增强,细胞膜结构被破坏。另外,体外竞争吸附试验表明,抗菌肽TP可以与EtBr竞争E.coli ATCC 25922基因组DNA碱基结合位点,结合力比EtBr对DNA的结合力更强。表明抗菌肽TP在杀菌过程中,增加细胞膜通透性,破坏膜结构,并有可能进入细菌细胞,结合胞内的DNA,使其DNA活性受阻。4、为检验TP对红细胞的毒性,采用细胞溶血性分析方法,检验抗菌肽TP对小鼠红细胞的毒性。结果表明,TP在320μM浓度下仍然有15%左右的溶血性,但与对照组PBS处理的溶血性相比差异不显著,而极显著低于1%Triton X-100处理后的溶血性(100%)(p0.01)。MTT分析结果表明,TP对原代绒山羊胎儿成纤维细胞的IC50=71.323μM的浓度比TP最敏感菌株的MIC(2.5–10μM)都要高。TP抑制人胃癌细胞系MKN-45和急性早幼粒白血病细胞系NB4的IC50浓度分别为4.686μM和11.479μM。NB4细胞使用TP处理后,提取RNA并进行实时定量分析,其癌细胞凋亡相关基因Bax表达量上升,Bcl2表达量下降,表明TP处理后癌细胞出现凋亡症状。因而TP对红细胞毒性小,对哺乳动物体细胞有轻微毒性,对癌细胞有抑制生长作用。该试验结果可应用于后续的临床检验和畜牧业生产。
【关键词】:藏猪 拮抗微生物 抗菌肽 最小抑菌浓度 抗肿瘤
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.6
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-15
  • 第一章 研究背景综述15-38
  • 1.1 研究背景15
  • 1.2 猪消化道菌群15-16
  • 1.2.1 消化道菌群平衡15-16
  • 1.2.2 菌群平衡的重要性16
  • 1.2.3 消化道微生态失衡及调控16
  • 1.3 抗生素饲用现状16-20
  • 1.3.1 饲用抗生素的益处17
  • 1.3.2 抗生素的常用种类17-18
  • 1.3.3 抗生素的滥用及危害18-20
  • 1.4 抗生素的替代品20-23
  • 1.4.1 微生态制剂20-21
  • 1.4.2 酶制剂21
  • 1.4.3 寡聚糖21-22
  • 1.4.4 植物提取物22
  • 1.4.5 抗菌肽22-23
  • 1.5 抗菌肽的研究现状23-36
  • 1.5.1 抗菌肽的分类23-25
  • 1.5.2 抗菌肽的理化性质25-26
  • 1.5.3 抗菌肽的抑菌机制26-27
  • 1.5.4 作用机制的研究方法27-29
  • 1.5.5 影响抗菌肽与细胞膜作用的因素29-31
  • 1.5.6 抗菌肽的制备方法31-34
  • 1.5.7 细菌抗菌肽研究现状34-36
  • 1.6 研究的目的与意义36-37
  • 1.7 研究的技术路线 (研究技术路线图)37-38
  • 第二章 藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选鉴定及其特性研究38-51
  • 2.1 引言38
  • 2.2 材料38-39
  • 2.2.1 仪器设备38
  • 2.2.2 本试验主要试剂38-39
  • 2.2.3 本试验所用菌株39
  • 2.2.4 试剂配制39
  • 2.2.5 培养基配制39
  • 2.3 试验方法39-42
  • 2.3.1 样品采集39
  • 2.3.2 致病菌拮抗微生物的筛选39-40
  • 2.3.3 致病菌拮抗微生物的鉴定40-41
  • 2.3.4 拮抗菌抗菌活性物质发酵产生的条件优化41-42
  • 2.3.5 拮抗菌分泌抑菌物质的生物学特性研究42
  • 2.4 结果与分析42-49
  • 2.4.1 拮抗致病菌的微生物筛选43
  • 2.4.2 拮抗致病菌微生物的鉴定43-44
  • 2.4.3 拮抗菌抗菌活性物质发酵产生的条件优化44-48
  • 2.4.4 拮抗菌分泌抑菌物质的生物学特性研究48-49
  • 2.5 讨论49-50
  • 2.6 小结50-51
  • 第三章 抗菌肽的分离纯化和鉴定51-61
  • 3.1 引言51
  • 3.2 试验材料51-53
  • 3.2.1 试剂51
  • 3.2.2 仪器设备51-52
  • 3.2.3 菌株52
  • 3.2.4 培养基配制52
  • 3.2.5 试剂配制52-53
  • 3.3 试验方法53-55
  • 3.3.1 样品准备53
  • 3.3.2 抗菌活性检测53
  • 3.3.3 反相液相色谱53-54
  • 3.3.4 超滤浓缩分离54
  • 3.3.5 C8反相高效液相色谱54
  • 3.3.6 C18色谱鉴定抗菌肽纯度54
  • 3.3.7 分子量和序列测定54-55
  • 3.3.8 生物信息学预测55
  • 3.4 结果与分析55-59
  • 3.4.1 反相液相色谱分离55
  • 3.4.2 超滤浓缩分离55
  • 3.4.3 C8反相高效液相色谱55-57
  • 3.4.4 Tricine-SDS-PAGE57-58
  • 3.4.5 质谱分析58
  • 3.4.6 二级结构预测58-59
  • 3.5 讨论59-60
  • 3.6 小结60-61
  • 第四章 抗菌肽的抑菌特性61-70
  • 4.1 引言61
  • 4.2 试验材料61-62
  • 4.2.1 菌种61
  • 4.2.2 仪器61
  • 4.2.3 试剂和培养基配制61-62
  • 4.3 试验方法62-64
  • 4.3.1 抑菌谱检测62-63
  • 4.3.2 动态杀菌曲线63
  • 4.3.3 扫描电镜观察细菌表面结构变化63
  • 4.3.4 细菌细胞膜作用检测63-64
  • 4.3.5 钾离子释放检测64
  • 4.3.6 抗菌肽和核酸作用检测-竞争性结合64
  • 4.4 结果与分析64-68
  • 4.4.1 抑菌谱检测64-65
  • 4.4.2 杀菌动力学65
  • 4.4.3 扫描电镜观察细菌表面结构变化65-66
  • 4.4.4 细菌细胞膜作用检测66
  • 4.4.5 钾离子释放检测66-67
  • 4.4.6 抗菌肽和核酸作用检测-竞争性结合67-68
  • 4.5 讨论68-69
  • 4.6 小结69-70
  • 第五章 抗菌肽的细胞毒性和抑癌特性70-79
  • 5.1 引言70
  • 5.2 试验材料70-71
  • 5.2.1 细胞70
  • 5.2.2 仪器70
  • 5.2.3 试剂配制70
  • 5.2.4 细胞培养基配制70-71
  • 5.3 试验方法71-74
  • 5.3.1 细胞培养71
  • 5.3.2 溶血性检测71
  • 5.3.3 哺乳动物体细胞毒性分析71-72
  • 5.3.4 癌细胞敏感性研究72-74
  • 5.4 试验结果与分析74-77
  • 5.4.1 溶血性分析74-75
  • 5.4.2 细胞毒性分析75
  • 5.4.3 癌细胞敏感性分析75-77
  • 5.5 讨论77
  • 5.6 小结77-79
  • 结论79-80
  • 创新点80-81
  • 进一步研究的问题81-82
  • 参考文献82-96
  • 附录96-98
  • 缩略词98-99
  • 致谢99-100
  • 作者简介100

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