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《西北农林科技大学》 2017年
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组蛋白甲基转移酶SETDB1调控雄性生殖干细胞存活的分子机制研究

刘田田  
【摘要】:具有干细胞特性的性原细胞及精原细胞统称为雄性生殖干细胞,这类干细胞可以自我更新维持干细胞库,也可以分化产生精子。精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是唯一可以将亲本遗传信息传递给后代的成体干细胞。SSCs可以分化为精原细胞并起始精子发生,这个过程需要严密的基因表达调控。基因的表达调控受到组蛋白修饰的影响。组蛋白H3和H4的赖氨酸残基上可以发生三种甲基化修饰,包括一、二和三甲基化。通常H3K4和H3K36的甲基化与基因的转录激活相关,而H3K9,H3K27和H4K20的甲基化与转录抑制相关。这些组蛋白的甲基化修饰受到甲基转移酶或去甲基化酶的催化。组蛋白甲基转移酶SETDB1(SET domain,bifurcated 1),也称为ESET,可通过H3K9me2/3调控异染色质的形成,抑制基因表达。SETDB1对于胚胎干细胞的维持、神经细胞的存活具有重要作用。本研究利用蛋白质免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、组织免疫荧光等技术研究了SETDB1调控小鼠精原干细胞存活的分子机制,以及SETDB1对猪性原细胞存活的调控作用。主要结果如下:(1)Setdb1敲低可引起C18-4细胞线粒体膜电位的下降,细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻及凋亡晚期DNA的断裂,且Setdb1-KD诱导了促凋亡基因Bax、Apaf1、p53、Caspase9表达的上调,抑凋亡基因XIAP表达下调。说明Setdb1干扰可以通过调节凋亡相关基因的表达调控细胞凋亡。(2)Setdb1-KD可激活PTEN,进而抑制AKT及FOXO1的磷酸化。Setdb1及Pten的双敲低可挽救细胞凋亡的发生,且反转了由于Setdb1-KD诱导的凋亡及通路相关蛋白的表达变化。说明了PTEN/AKT/FOXO1通路参与了Setdb1-KD诱导的小鼠精原干细胞凋亡。(3)SETDB1可与AKT相互作用,且SETDB1可以增强AKT对下游靶蛋白FOXO1的调控,抑制FOXO1的入核,从而抑制其自身启动子的转录活性。Setdb1-KD可诱导FOXO1进核,并激活促凋亡基因Bim和Puma的表达。说明SETDB1可以协同AKT调控FOXO1活性并影响下游靶基因的表达。(4)H3K9me3-ChIP结果显示,Setdb1-KD导致了基因Pten、Foxo3和Bim启动子区域H3K9me3水平的降低,而Foxo1、Puma、Bax和Bcl2启动子区域的H3K9me3无显著变化。另外,SETDB1-ChIP显示,SETDB1可以直接结合到Pten、Bim、Puma和Bax基因启动子区域。结果说明,SETDB1只负责部分基因启动子上H3K9me3修饰,且SETDB1可以通过直接作用于Pten及Bim启动子区域催化H3K9me3修饰,从而调控小鼠精原干细胞的存活。(5)在猪睾丸发育过程中,SETDB1的表达量随着猪的发育逐渐升高,而H3K9me3的表达水平在出生7天猪睾丸中表达量最高。在7天和两月龄猪的睾丸组织中,SETDB1在性原细胞和精原干细胞中呈胞质分布,而H3K9me3呈核周分布。在成年猪睾丸组织中,SETDB1定位于精原干细胞和分化的精原细胞的细胞核,而H3K9me3在精原干细胞中呈核周分布,在分化的精原细胞中呈斑点状分布。(6)为了研究SETDB1在猪性原细胞中的功能,通过差异贴壁富集性原细胞,富集后的性原细胞纯度可达到76.5%±3.9%。通过Western及RT-PCR结果发现,SETDB1主要表达于性原细胞。说明SETDB1在调控猪性原细胞的存活上可能发挥着重要功能。(7)SETDB1干扰引起猪性原细胞凋亡,且凋亡的发生不依赖于H3K9me3;另外,SETDB1可与催化H3K27甲基化的甲基转移酶EZH2结合,且SETDB1敲低引起H3K27me3水平的降低,说明SETDB1干扰调控猪性原细胞的凋亡是通过H3K27me3水平调控的。综上所述,通过PTEN/AKT/FOXO1通路及H3K9me3水平,Setdb1-KD诱导小鼠精原干细胞的凋亡;SETDB1协同AKT参与对下游靶蛋白FOXO1的活性调控。同时,SETDB1-KD也诱导猪性原细胞凋亡,但是H3K9me3水平并未改变,而与SETDB1结合的组蛋白甲基转移酶EZH2催化的H3K27me3水平的降低有关。本研究揭示了表观遗传机制和凋亡信号通路之间的关系,并填补了表观遗传调控雄性生殖干细胞存活研究领域的空缺,为今后雄性不育的研究提供了新的思路。
【关键词】:精原干细胞 性原细胞 SETDB1 凋亡 组蛋白甲基化
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q23
【目录】:
  • 摘要6-8
  • ABSTRACT8-15
  • 第一部分 文献综述15-41
  • 第一章 雄性生殖干细胞增殖与分化的研究进展15-23
  • 1.1 精原干细胞15-17
  • 1.2 调控精原干细胞命运的转录因子17-19
  • 1.3 调控精原干细胞自我更新与分化的信号通路19-23
  • 1.3.1 Janus激酶/信号转导子和转录激活子信号通路(JAK/STAT)19-20
  • 1.3.2 Src信号通路20
  • 1.3.3 磷酸肌醇 3-激酶(PI3K)/AKT通路20
  • 1.3.4 Ras/Erk1/2 信号通路20-21
  • 1.3.5 Smad信号通路21-23
  • 第二章 表观遗传调控的研究进展23-31
  • 2.1 表观遗传学的定义23-24
  • 2.2 DNA甲基化与基因表达调控24
  • 2.3 组蛋白修饰与基因表达调控24-31
  • 2.3.1 H3K9甲基转移酶及其介导的基因沉默25-27
  • 2.3.2 H3K27甲基转移酶及其介导的基因沉默27-29
  • 2.3.3 H4K20甲基转移酶及其介导的基因沉默29
  • 2.3.4 组蛋白乙酰化与基因转录调控29-31
  • 第三章 精子发生过程的表观修饰研究进展31-34
  • 3.1 DNA甲基化与表观遗传重编程31
  • 3.2 基因印记31-32
  • 3.3 组蛋白修饰32-33
  • 3.4 核蛋白转换33-34
  • 第四章 SETDB1研究进展34-41
  • 4.1 SETDB1的结构特点34-35
  • 4.2 SETDB1在早期发育中的功能35-36
  • 4.3 SETDB1在胚胎干细胞中的功能36-38
  • 4.4 SETDB1在染色质重塑及体细胞重编程中的功能38-39
  • 4.5 SETDB1在其他方面的功能39-40
  • 4.6 本研究的目的意义40-41
  • 第二部分 试验研究41-96
  • 第五章 Setdb1干扰诱导小鼠精原干细胞凋亡41-53
  • 5.1 材料和方法41-46
  • 5.1.1 细胞系41
  • 5.1.2 主要仪器设备41
  • 5.1.3 主要试剂和配制41-42
  • 5.1.4 si RNA转染C18-4 细胞系42
  • 5.1.5 线粒体膜电位的检测42-43
  • 5.1.6 Annexin V-FITC/PI染色及流式细胞仪检测43
  • 5.1.7 TUNEL凋亡检测43
  • 5.1.8 细胞活力检测43
  • 5.1.9 蛋白提取及Western blot检测43-45
  • 5.1.10 RNA提取及RT-PCR检测45-46
  • 5.2 结果46-52
  • 5.2.1 C18-4 细胞的鉴定46-47
  • 5.2.2 Setdb1干扰效率检测47-48
  • 5.2.3 Setdb1-KD引起细胞凋亡的表型分析48
  • 5.2.4 Setdb1-KD引起早期细胞凋亡的检测48-50
  • 5.2.5 Setdb1-KD引起晚期细胞凋亡的TUNEL检测50-51
  • 5.2.6 Setdb1-KD诱导凋亡相关基因及蛋白表达的分析51-52
  • 5.3 讨论52
  • 5.4 小结52-53
  • 第六章 PTEN/AKT/FOXO1通路参与Setdb1-KD诱导的小鼠精原干细胞凋亡53-60
  • 6.1 材料与方法53-55
  • 6.1.1 主要仪器设备53
  • 6.1.2 抗体及试剂53-54
  • 6.1.3 si RNA转染C18-4 细胞系54
  • 6.1.4 TUNEL凋亡检测54
  • 6.1.5 细胞活力检测54
  • 6.1.6 蛋白提取及Western blot检测54
  • 6.1.7 RNA提取及RT-PCR检测54-55
  • 6.2 结果55-58
  • 6.2.1 Setdb1-KD正调控PTEN/AKT/FOXO1通路55-56
  • 6.2.2 Pten干扰效率检测56
  • 6.2.3 PTEN干扰挽救了Setdb1-KD诱导的细胞凋亡的表型分析56-57
  • 6.2.4 Pten与Setdb1共转染后凋亡相关基因表达的检测57-58
  • 6.3 讨论58-59
  • 6.4 小结59-60
  • 第七章 SETDB1协同AKT表观调控小鼠精原干细胞存活60-73
  • 7.1 材料与方法60-65
  • 7.1.1 质粒和菌株60
  • 7.1.2 主要仪器设备60
  • 7.1.3 主要试剂60-61
  • 7.1.4 Setdb1和Akt载体的构建61-62
  • 7.1.5 Western blot62
  • 7.1.6 细胞的免疫荧光62-63
  • 7.1.7 SETDB1与AKT互作63
  • 7.1.8 荧光素酶报告实验(Luciferase reporter assay)63-64
  • 7.1.9 染色质免疫共沉淀(Ch IP)试验64-65
  • 7.1.10 RT-PCR65
  • 7.2 结果65-70
  • 7.2.1 相关载体的构建65-66
  • 7.2.2 SETDB1与AKT互作66-67
  • 7.2.3 SETDB1协同AKT调控FOXO1活性67-68
  • 7.2.4 Setdb1-KD导致FOXO1细胞核定位分析68-69
  • 7.2.5 FOXO1调控Bim和Puma的表达69
  • 7.2.6 Setdb1-KD通过H3K9甲基转移酶活性调控SSCs凋亡69-70
  • 7.3 讨论70-72
  • 7.4 小结72-73
  • 第八章 SETDB1在猪睾丸发育中的时序表达与定位73-82
  • 8.1 材料和方法73-77
  • 8.1.1 实验样品73
  • 8.1.2 主要仪器设备73
  • 8.1.3 主要试剂和配制73-74
  • 8.1.4 猪睾丸组织的样品制备、RNA及蛋白提取74-75
  • 8.1.5 Real time RT-PCR检测及Western blot检测75-76
  • 8.1.6 免疫组织化学染色76
  • 8.1.7 组织免疫荧光染色76-77
  • 8.2 结果77-80
  • 8.2.1 SETDB1和H3K9me3在猪睾丸发育中的表达77-78
  • 8.2.2 SETDB1和H3K9me3在猪睾丸中的表达分布78-79
  • 8.2.3 SETDB1及H3K9me3在猪性原细胞/精原干细胞的定位79
  • 8.2.4 SETDB1及H3K9me3在成年猪睾丸精原干细胞及精原细胞中的表达分布79-80
  • 8.3 讨论80-81
  • 8.4 小结81-82
  • 第九章 SETDB1在猪性原细胞中的功能82-96
  • 9.1 材料与方法82-87
  • 9.1.1 质粒和菌株82
  • 9.1.2 主要仪器设备82
  • 9.1.3 主要试剂82-83
  • 9.1.4 SETDB1和EZH2载体的构建83-84
  • 9.1.5 RT-PCR84
  • 9.1.6 Western blot84
  • 9.1.7 睾丸组织的消化及性原细胞富集84-85
  • 9.1.8 si RNA转染性原细胞85
  • 9.1.9 细胞的免疫荧光85-86
  • 9.1.10 TUNEL凋亡检测86
  • 9.1.11 SETDB1与EZH2互作86-87
  • 9.2 结果87-94
  • 9.2.1 p Bi FC155SETDB12001和p Bi FC173EZH2载体的构建87
  • 9.2.2 猪性原细胞及支持细胞的消化及富集87-88
  • 9.2.3 SETDB1在猪支持细胞和性原细胞中的表达水平88-89
  • 9.2.4 SETDB1在猪性原细胞中的功能研究89-90
  • 9.2.5 SETDB1-KD引起猪性原细胞发生凋亡90-92
  • 9.2.6 SETDB1-KD对猪支持细胞无影响92-93
  • 9.2.7 SETDB1与EZH2相互作用93-94
  • 9.3 讨论94-95
  • 9.4 小结95-96
  • 结论96-97
  • 本研究创新点97
  • 后续研究工作97-98
  • 参考文献98-119
  • 致谢119-120
  • 作者简介120

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