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《西北农林科技大学》 2017年
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微流控肝小叶样三维微组织仿生构筑

马超  
【摘要】:肝脏是人体最大的内脏器官,发挥着诸多重要功能,如代谢、合成、免疫和解毒等。肝组织工程,由来自两个方面的需求驱动,在过去的三十年间经历了快速发展。第一个方面来自临床上肝脏移植。肝移植是治疗终末期肝衰竭等肝脏疾病的唯一的有效手段。然而,肝移植治疗手段受制于肝供体的短缺、移植后的免疫排斥和移植耗费巨大等问题。这些情况使得体外构建功能性肝组织移植体尤为重要。另一方面,当前药物开发过程中,药物诱导肝损伤是难以预料的不良反应,导致药物开发效率低下、成本提升。当前,医药企业依赖于二维肝细胞培养模型和实验动物模型进行体外和体内药物分析。然而,二维细胞模型难以再现体内肝脏的三维生理微环境;实验动物模型具有工作繁重、耗费巨大、动物福利等问题,且与人体在代谢通路上存在物种差异,获得的结果无法推广到人体试验中。因此,医药企业也迫切寻求优势的体外肝脏模型进行药物肝毒性的临床前预筛选,加快药物筛选进程和提高药物筛选效率。为了满足上述需求,本研究提出并验证了两种基于微流控芯片技术的策略,实现了肝组织体外工程化构筑。简言之:策略一构建了肝小叶样肝脏芯片,并将其应用于药物肝毒性和药物-药物相互作用诱导的不良反应分析;策略二研发了气动辅助微模塑方法,实现了肝小叶样载细胞微凝胶的制备。本研究的完成为体外药物肝毒性分析提供了模型支持,同时也为多尺度的肝组织工程技术的发展提供了新的思路。本论文所得到的研究结果如下:1.本研究利用AutoCAD软件设计了一种模拟肝小叶的多层微流控芯片,并结合光刻技术和多层软蚀刻技术制备了符合设计的仿生微流控芯片。自上而下观察,该芯片具有四层结构,分别为流动层、控制层、支持层和载玻片层。其中,流动层具有细胞培养微腔室,腔室内分布有多重微柱阵列;控制层集成有气动控制系统,用于实现肝细胞和内皮细胞的共定位和区域化接种。通过对芯片加工过程中流动层与控制层的键合时间的探索,本研究制备出了具有结构完整、性能良好、层与层之间紧密粘合的集成仿生微流控芯片。不同压力驱动试验显示18 psi可以实现气动控制系统的成功运行,为后续构建肝小叶样肝脏芯片提供了关键参数。2.本研究通过顺序灌注肝细胞(HepG2)和内皮细胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)及程序化操作气动控制系统实现了肝脏芯片的成功构建。共聚焦图像显示,本研究所构建的肝脏芯片具有肝小叶样的组织形态,即HepG2细胞形成的肝细胞索样结构和HAEC细胞形成的肝血窦样结构。肝代谢酶活力分析显示,肝小叶样肝脏芯片具有较高的基础CYP-1A1/2和UGT酶活力,同时动态应答于CYP-1A1/2和UGT酶的诱导剂和抑制剂。药物毒性测试结果显示,肝小叶样肝脏芯片较好地响应于不同药物诱导的肝毒性,提示该芯片具有较高的药物代谢能力。3.应用肝小叶样肝脏芯片,本研究成功地分析了由不同药物组合间的相互作用诱导产生的肝毒性。预先使用可诱导或抑制CYP-1A1/2和UGT酶活力的药物处理肝脏芯片,之后使用另一种药物再次处理,结果显示后施加药物的肝毒性受到了前施加药物的影响。这些结果提示肝小叶样肝脏芯片可以为临床前的药物不良反应分析提供体外肝组织模型。4.作为本论文的另一部分,本研究提出了一种新型的载细胞微凝胶的制备方法,称作气动辅助微模塑(Pneumatic-aided micro-molding,PAM)。气动辅助微模塑利用微流控芯片中预先设计的微阀门实现限制区域内的凝胶固化,进而实现载细胞凝胶的可控制备。应用该方法,本研究实现了具有多种几何形状(三角形、正方形和圆形)的、包裹不同细胞类型(HepG2细胞、NIH 3T3成纤维细胞和A549细胞)的、不同凝胶种类(胶原、明胶和琼脂)的微凝胶的可控制备。本研究通过调整微阀门的结构设计,实现了微凝胶中单个或多个特定形状微通道的整合以及多个微通道的特定布局。此外,使用微阀门系统实现两步气动辅助微模塑过程,本研究也成功地制备了包裹不同细胞种类的多组分或多区隔化的微凝胶。5.本研究构建了集成有气动辅助微模塑功能的微流控芯片,实现了肝小叶样载细胞微凝胶的制备。形态学观察显示,载细胞微凝胶呈现出肝小叶样的组织形态,即肝细胞(HepG2)为条索状分布,而内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell-C,HUVEC-C)与肝细胞间隔分布。基于肝小叶样微组织,本研究分析了扑热息痛的肝毒性和谷胱甘肽的肝保护作用。
【关键词】:微流控 肝小叶 药物分析 载细胞微凝胶 气动辅助微模塑
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R318
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-15
  • 文献综述15-49
  • 第一章 多尺度肝组织工程研究进展15-49
  • 1.1 肝脏的结构与功能16-19
  • 1.1.1 肝脏的细胞类型16
  • 1.1.2 肝脏的微结构16-17
  • 1.1.3 肝脏的微环境与生理功能及特征指标17-19
  • 1.2 宏观尺度的肝组织工程研究进展19-25
  • 1.2.1 传统肝组织工程19-22
  • 1.2.2 全器官生物工程22-24
  • 1.2.3 生物人工肝24-25
  • 1.3 微观尺度的肝组织工程研究进展25-39
  • 1.3.1 微流控芯片技术25-26
  • 1.3.2 微流控芯片上的肝脏微环境模拟26-30
  • 1.3.3 微流控芯片上的肝脏微结构模拟30-36
  • 1.3.4 微流控肝脏芯片上药物研究36-39
  • 1.4 介观尺度的肝组织工程研究进展39-46
  • 1.4.1 细胞三维堆叠培养39-41
  • 1.4.2 载细胞微凝胶41-43
  • 1.4.3 生物三维打印技术43-45
  • 1.4.4 类器官培养方法45-46
  • 1.5 结论和展望46-47
  • 1.6 本研究的目的和意义47-49
  • 试验研究49-147
  • 第一篇 肝小叶样肝脏芯片的仿生构筑及其应用49-92
  • 第二章 肝小叶样肝脏芯片的微流控芯片加工与功能验证51-62
  • 2.1 材料51-52
  • 2.1.1 主要试剂和耗材51
  • 2.1.2 主要仪器和设备51-52
  • 2.1.3 实验试剂及配制52
  • 2.2 方法52-56
  • 2.2.1 微流控芯片设计与光掩膜打印52
  • 2.2.2 微流控芯片模具加工52-53
  • 2.2.3 微流控芯片制备53-54
  • 2.2.4 微流控芯片的操作与控制54
  • 2.2.5 图像采集与分析54-56
  • 2.3 结果与讨论56-61
  • 2.3.1 芯片设计与制备56-58
  • 2.3.2 气动控制系统展示与操作58-60
  • 2.3.3 气动控制系统工作压力选择60-61
  • 2.4 小结61-62
  • 第三章 肝小叶样肝脏芯片构筑及其用于药物-药物相互作用分析62-92
  • 3.1 材料62-64
  • 3.1.1 主要试剂与耗材62-63
  • 3.1.2 主要仪器和设备63
  • 3.1.3 实验试剂及配制63-64
  • 3.2 方法64-68
  • 3.2.1 微流控芯片灭菌处理64-65
  • 3.2.2 细胞培养65
  • 3.2.3 肝小叶样肝脏芯片构建65
  • 3.2.4 药物处理浓度选择与MTT试验65-66
  • 3.2.5 细胞染色66
  • 3.2.6 细胞培养模型定义66
  • 3.2.7 肝代谢酶活力表征66-67
  • 3.2.8 药物肝代谢能力测试67
  • 3.2.9 药物-药物相互作用分析67-68
  • 3.2.10 图像采集与分析68
  • 3.3 结果与讨论68-91
  • 3.3.1 肝小叶样肝脏芯片构建68-71
  • 3.3.2 肝小叶样肝脏芯片的培养与活力鉴定71-75
  • 3.3.3 肝小叶样肝脏芯片的三维观察75-76
  • 3.3.4 肝小叶样肝脏芯片的肝代谢酶活力表征76-78
  • 3.3.5 基于肝小叶样肝脏芯片的药物肝毒性分析78-88
  • 3.3.6 基于肝小叶样肝脏芯片的药物-药物相互作用分析88-91
  • 3.4 小结91-92
  • 第二篇 气动辅助微模塑方法建立及其用于肝小叶样微组织构筑92-147
  • 第四章 基于微流控芯片技术的气动辅助微模塑方法建立93-131
  • 4.1 材料94-95
  • 4.1.1 主要试剂与耗材94
  • 4.1.2 主要仪器和设备94-95
  • 4.1.3 实验试剂及配置95
  • 4.2 方法95-99
  • 4.2.1 微流控芯片设计与光掩膜打印95-96
  • 4.2.2 微流控芯片模具加工96-97
  • 4.2.3 微流控芯片制备97-98
  • 4.2.4 微流控芯片的操作与控制98
  • 4.2.5 微流控芯片预处理98
  • 4.2.6 细胞培养98
  • 4.2.7 细胞染色98
  • 4.2.8 图像采集与分析98-99
  • 4.3 结果与讨论99-130
  • 4.3.1 气动辅助微模塑方法的设计概念99-107
  • 4.3.2 制备具有单个形状可控的微通道的载细胞微凝胶107-115
  • 4.3.3 制备具有多个形状和布局可控的微通道的载细胞微凝胶115-121
  • 4.3.4 制备载异种细胞的多组分微凝胶121-130
  • 4.4 小结130-131
  • 第五章 气动辅助微模塑构筑肝小叶样载细胞微凝胶组织131-147
  • 5.1 材料132-134
  • 5.1.1 主要试剂和耗材132
  • 5.1.2 主要仪器和设备132-133
  • 5.1.3 实验试剂及配制133-134
  • 5.2 方法134-138
  • 5.2.1 微流控芯片设计与光掩膜打印134
  • 5.2.2 微流控芯片模具加工134-135
  • 5.2.3 微流控芯片制备135-136
  • 5.2.4 微流控芯片的操作与控制136
  • 5.2.5 细胞培养136
  • 5.2.6 细胞染色136-137
  • 5.2.7 肝小叶样载细胞微凝胶组织制备137-138
  • 5.3 结果与讨论138-146
  • 5.3.1 集成微流控芯片设计与加工138-139
  • 5.3.2 微流控芯片控制系统操作条件优化139-143
  • 5.3.3 肝小叶样载细胞微凝胶制备143-145
  • 5.3.4 药物肝毒性与保肝药效分析145-146
  • 5.4 小结146-147
  • 研究结论147-148
  • 本研究的创新点148-149
  • 参考文献149-163
  • 缩略词163-166
  • 致谢166-167
  • 作者简介167

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