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《西北农林科技大学》 2017年
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应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛

高元鹏  
【摘要】:结核病是一种由结核分枝杆菌感染造成的人畜共患病,全球范围内潜在感染人口多达20亿,其中约5-10%的携带者会出现临床症状,每年可造成约150万死亡病例。牛结核病由牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)感染造成,同时可经由直接接触患病动物或未消毒的乳肉制品引起人类患病。由于野生宿主广泛存在、畜牧产品交易全球化和高效疫苗缺失,M.bovis感染造成的牛结核病至今在非洲、拉丁美洲和亚洲等地区依然未能被有效控制,对人类健康和农业发展造成严重影响。研究者普遍认为宿主对结核分枝杆菌感染的抵抗力与多种遗传因素相关,其中多项研究表明NRAMP1基因在机体中的表达水平与结核杆菌的抵抗力间存在依赖关系。本研究的前期工作同样证明了提高NRAMP1基因的表达量可以有效增强宿主细胞的抗结核能力。因而,本研究旨在通过转基因方法提高NRAMP1基因的表达量,培育出抗结核的转基因牛新品种。作为当前广泛使用的转基因动物生产工具,CRISPR/Cas9系统已被应用于小鼠、猪、山羊及猴等物种。同时,多种针对于Cas9蛋白本身的突变及相应的转基因策略已经被提出以减少目前最广泛关注的脱靶效应问题,并取得了瞩目成绩。然而关于哺乳动物基因组上外源功能基因插入的报道非常有限,而验证这些打靶策略在转基因牛生产上的可行性,同样具有重要的应用价值。本研究首次应用单个Cas9缺口酶(Cas9n)来诱导功能基因插入并生产出了基因组范围内脱靶效应减弱的转基因牛。进一步的体外与体内攻菌实验表明NRAMP1基因可以通过增加表达量激活巨噬细胞凋亡通路,限制胞内M.bovis的增殖进而提高转基因牛的结核病抗性。本研究主要内容如下:1.在牛基因组上选择了25号染色体上FSCN1基因和ACTB基因间区域作为打靶基因座。应用CRISPR/Cas9设计软件ZiFiT与Cas-OFFinder,初步筛选出全基因组范围内潜在脱靶位点最少的sgRNA序列。构建基因打靶载体,在BFFs上应用Surveyor错配核酸酶检测野生型Cas9核酸酶在各基因打靶位点的切割效率。进一步设计供体载体,比较野生型Cas9核酸酶、成对Cas9切口酶、单一Cas9切口酶等不同打靶策略在相应打靶位点的切割效率与外源基因整合效率。2.应用没有核酸酶活性的dCas9在BFFs上进行ChIP-seq实验,鉴定各打靶位点对应的dCas9:sgRNA复合物在牛基因组上的主要识别与结合位点。通过分析CRISPR/Cas9系统在牛基因组上的主要结合特点与影响因素,获取了各打靶位点对应的潜在脱靶位点信息,建立了转基因牛生产中脱靶效应的评估标准。3.构建针对45号位点的Cas9核酸酶与Cas9切口酶基因打靶载体及对应供体载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro-1/2,共转染牛胎儿成纤维细胞后应用嘌呤霉素筛选出外源基因稳定整合的克隆。通过junction PCR、Sanger测序、Southern blot和绝对定量鉴定出NRAMP1基因定点整合的阳性克隆。进一步以阳性细胞为供核细胞,进行体细胞核移植与胚胎移植操作,最终获得了11头NRAMP1转基因奶牛。4.针对转基因牛进行体外结核分枝杆菌攻菌实验,Western blot、流式细胞术凋亡检测和CFU计数结果表明攻菌后NRAMP1基因可以通过增加表达量激活巨噬细胞凋亡通路,限制胞内M.bovis的增殖。进一步对NRAMP1转基因牛进行体内攻菌实验,IFN-γ释放水平检测和酶联免疫斑点实验证明NRAMP1转基因牛可以有效抵抗结核分枝杆菌感染,具备增强的抗结核能力。综上所述,本研究应用单一Cas9切口酶技术介导NRAMP1基因精准插入,并成功获得11头转基因牛;首次在BFFs上进行dCas9 Ch IP-seq实验,并在BFFs与转基因牛个体水平证明了应用单一Cas9切口酶进行基因打靶可在基因组范围内减少脱靶效应;进一步通过体外与体内攻菌实验证明了NRAMP1转基因牛具有增强的抗结核感染能力,为抗病转基因育种提供了宝贵材料。
【关键词】:CRISPR/Cas9切口酶 基因插入 NRAMP1 脱靶效应 转基因牛
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S823;Q78
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-13
  • 文献综述13-41
  • 第一章 转基因动物生产研究进展13-27
  • 1.1 转基因动物生产的发展历程13-14
  • 1.2 基因编辑技术研究进展14-22
  • 1.2.1 基因编辑技术机理14-16
  • 1.2.2 锌指核酸酶16-18
  • 1.2.3 TALE核酸酶18-20
  • 1.2.4 CRISPR/Cas920-22
  • 1.3 转基因动物生产的应用22-27
  • 1.3.1 提高动物生产性能22-24
  • 1.3.2 在生物医学上的应用24-25
  • 1.3.3 提高动物抗病能力25-27
  • 第二章 CRISPR/Cas9系统及转基因动物生产27-41
  • 2.1 CRISPR系统概述27-29
  • 2.1.1 CRISPR系统的发现历程27-28
  • 2.1.2 CRISPR系统的分类28-29
  • 2.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术29-37
  • 2.2.1 CRISPR/Cas9系统的结构29-31
  • 2.2.2 CRISPR/Cas9对靶位点的识别与切割31-32
  • 2.2.3 CRISPR/Cas9的打靶精准性32-37
  • 2.3 CRISPR/Cas9在动物转基因上的应用37-41
  • 2.3.1 NHEJ介导的基因敲除37-39
  • 2.3.2 HDR介导的基因定点整合39
  • 2.3.3 转录调控基因表达39-41
  • 实验研究41-119
  • 第三章 CRISPR/Cas9打靶位点的筛选及活性检测41-61
  • 3.1 材料和试剂42
  • 3.1.1 材料42
  • 3.1.2 试剂42
  • 3.2 方法42-49
  • 3.2.1 打靶基因座的选择42-43
  • 3.2.2 打靶位点的软件预测与筛选43-44
  • 3.2.3 CRISPR/Cas9真核表达载体构建44-45
  • 3.2.4 CRISPR/Cas9打靶位点的切割效率检测45-47
  • 3.2.5 CRISPR/Cas9打靶策略选择与活性检测47-49
  • 3.3 结果49-58
  • 3.3.1 打靶基因座的选择49-50
  • 3.3.2 打靶位点的软件预测与筛选50-52
  • 3.3.3 CRISPR/Cas9真核表达载体构建52-53
  • 3.3.4 CRISPR/Cas9打靶位点的切割效率检测53-56
  • 3.3.5 不同打靶策略下Cas9系统活性检测56-58
  • 3.4 讨论58-59
  • 3.5 小结59-61
  • 第四章 牛胎儿成纤维细胞中sgRNA-dCas9结合位点的鉴定61-81
  • 4.1 材料和试剂61-62
  • 4.1.1 材料61
  • 4.1.2 试剂61-62
  • 4.2 方法62-69
  • 4.2.1 dCas9真核表达载体构建62
  • 4.2.2 dCas9-sgRNA在BFFs基因组的结合位点鉴定62-69
  • 4.3 结果69-79
  • 4.3.1 dCas9真核表达载体构建69
  • 4.3.2 dCas9-sgRNA在BFFs基因组的结合位点鉴定69-74
  • 4.3.3 主要结合位点的特点分析74-76
  • 4.3.4 主要结合位点的实际脱靶效应验证76-79
  • 4.4 讨论79-80
  • 4.5 小结80-81
  • 第五章 NRAMP1精准插入的重组细胞筛选及转基因牛生产81-103
  • 5.1 材料和试剂81-82
  • 5.1.1 材料81
  • 5.1.2 试剂81-82
  • 5.2 方法82-89
  • 5.2.1 牛NRAMP1基因功能验证82-84
  • 5.2.2 同源重组供体载体构建84-86
  • 5.2.3 细胞筛选及鉴定86-88
  • 5.2.4 体细胞核移植生产转基因牛88-89
  • 5.3 结果89-100
  • 5.3.1 牛NRAMP1基因的功能验证89-91
  • 5.3.2 同源重组供体载体构建91-94
  • 5.3.3 阳性克隆鉴定94-99
  • 5.3.4 体细胞核移植生产转基因牛99-100
  • 5.4 讨论100-101
  • 5.5 小结101-103
  • 第六章 转NRAMP1克隆牛的功能验证103-119
  • 6.1 材料和试剂103-104
  • 6.1.1 材料103-104
  • 6.1.2 试剂104
  • 6.2 方法104-108
  • 6.2.1 NRAMP1转基因牛精准打靶验证104-106
  • 6.2.2 NRAMP1转基因牛的抗结核能力验证106-108
  • 6.3 结果108-116
  • 6.3.1 NRAMP1转基因牛精准打靶验证108-111
  • 6.3.2 NRAMP1转基因牛的抗结核能力验证111-116
  • 6.4 讨论116-118
  • 6.5 小结118-119
  • 全文结论119-120
  • 创新之处与进一步研究课题120-121
  • 创新之处120
  • 进一步研究课题120-121
  • 参考文献121-142
  • 附录142-166
  • 缩略词166-169
  • 致谢169-170
  • 作者简介170

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