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《西北农林科技大学》 2017年
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结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中STAT1介导的信号转导和免疫调控的机理研究

姚柯桢  
【摘要】:结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病,病原菌可通过病畜传播给人群。其中牛结核分枝杆菌比同属的其他结核杆菌菌种对其他种类的动物的传播性更广泛。结核病的传播流行不仅影响畜牧业的发展,而且严重威胁人类的健康。至今为止,牛结核病造成的损失远远超过其他疫病造成的损失的总数。而在那些牛结核病流行的国家,由于有效的药物缺乏和耐药菌种的不断出现,人类结核病得不到有效的控制,成为了成年人传染病的首要杀手,对公共卫生造成了极大的损害。要从根本上解决这个问题,必须从结核病的感染机理上进行深入研究。结核杆菌是引起结核病的一种胞内寄生菌。结核杆菌感染宿主后,可被宿主体内的巨噬细胞吞噬。结核菌可由巨噬细胞经吞噬作用直接消除,也可在巨噬细胞中长期存活。凋亡途径是巨噬细胞的天然免疫屏障作用,可限制结核菌在宿主内的繁殖和扩增。结核杆菌通过结合细胞表面Toll样受体后激活巨噬细胞。活化的巨噬细胞通过细胞内多条信号通路,诱导自身凋亡,达到清除病原菌的目的。然而随着病菌和宿主免疫系统的共同进化,结核杆菌也进化出通过降低巨噬细胞凋亡率的方式获得免疫逃逸的生存机会。本文主要研究了结核杆菌H37Ra感染RAW264.7小鼠巨噬细胞系,巨噬细胞中JAK/STAT通路介导的免疫调控。本研究的主要研究内容如下:1.在结核杆菌感染巨噬细胞早期(1小时内),细胞内JAK/STAT通路快速激活,STAT1迅速磷酸化,下游促凋亡因子活化转录。肿瘤坏死因子表达升高,Caspase-3剪切体增多,巨噬细胞凋亡率上升。加入磷酸化抑制剂AG490后,STAT1磷酸化受阻,肿瘤坏死因子和Caspase-3的表达降低,巨噬细胞的凋亡率下降。2.在结核杆菌感染巨噬细胞后期(48小时),随着感染时间的延长,细胞内磷酸化STAT1含量下降,相反,细胞中非磷酸化STAT1蛋白大量积累。非磷酸化STAT1的浓度的升高和细胞内的活菌量的升高趋势一致。为了进一步研究非磷酸化STAT1蛋白在结核感染的巨噬细胞中的功能,本研究构建了稳定表达磷酸化位点突变的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬细胞系。实验结果表明,巨噬细胞感染结核菌后,非磷酸化STAT1蛋白发生进核效应,并调控下游一系列免疫及凋亡相关基因的转录。并且,非磷酸化STAT1蛋白的表达影响细胞中Caspase-3的激活,细胞色素c的释放,而增强表达抗凋亡蛋白Mcl-1的含量。Jak1是STAT1磷酸化的重要激酶,非磷酸化STAT1通过抑制Jak1激酶的表达,负反馈调节抑制STAT1的磷酸化。3.为更好的研究非磷酸化STAT1蛋白的调控模式,本研究利用RAW264.7小鼠巨噬细胞系为模型研究了非磷酸化STAT1蛋白相互作用组。构建了稳定表达生物素修饰的非磷酸化STAT1蛋白的小鼠巨噬细胞系。采用链亲合素亲和纯化技术捕获非磷酸化STAT1蛋白复合物,利用质谱测序技术鉴定出其149种相互作用蛋白。免疫印迹实验验证了部分相互作用靶蛋白。生物信息学聚类分析发现相互作用蛋白组富集在抗原呈递和疾病反应等重要免疫信号通路上。4.进一步研究表明,非磷酸化STAT1与STAT3形成异源二聚体,结合在CD95基因启动子上,调控CD95的转录,进一步抑制巨噬细胞中CD95/CD95L介导的细胞凋亡。另外,细胞质中非磷酸化STAT1可竞争性结合在其另一个靶蛋白eEF1A上,破坏促凋亡复合体eEF1A/IFIT1的稳定性,导致细胞凋亡被抑制。综上所述,STAT1转录蛋白在结核杆菌感染小鼠巨噬细胞的过程中扮演了双刃剑的角色。结核杆菌感染早期,磷酸化STAT1促进巨噬细胞凋亡作用,发挥病原菌抑制子的作用;感染后期,非磷酸化STAT1抑制巨噬细胞凋亡作用,利于结核菌在细胞内存活和增殖,造成结核杆菌的免疫逃逸。
【关键词】:STAT1 结核杆菌 巨噬细胞 蛋白相互作用组 小鼠
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.618
【目录】:
  • 摘要6-8
  • Abstract8-15
  • 第一章 文献综述15-35
  • 1.1 结核杆菌及结核病研究进展15-19
  • 1.1.1 结核杆菌15-16
  • 1.1.2 结核病发病机制16-18
  • 1.1.3 结核病诊断18-19
  • 1.2 结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用19-22
  • 1.2.1 结核分枝杆菌感染引起巨噬细胞信号转导19-21
  • 1.2.2 结核分枝杆菌感染引起巨噬细胞凋亡和坏死21-22
  • 1.3 病原菌诱导巨噬细胞凋亡研究22-25
  • 1.3.1 线粒体介导的细胞凋亡22-24
  • 1.3.2 CD95/CD95L介导的细胞凋亡24-25
  • 1.4 JAK/STAT信号通路研究进展25-32
  • 1.4.1 JAK/STAT通路25-26
  • 1.4.2 JAK/STAT通路在免疫应答中的作用26-29
  • 1.4.3 抑制JAK/STAT通路影响免疫逃逸29-31
  • 1.4.4 非磷酸化STAT的研究进展31-32
  • 1.5 eEF1A促进细胞凋亡32-34
  • 1.5.1 eEF1A参与细胞蛋白翻译32-33
  • 1.5.2 eEF1A参与到细胞凋亡的研究进展33-34
  • 1.6 本研究的内容和意义34-35
  • 第二章 感染早期磷酸化STAT1诱导巨噬细胞凋亡35-43
  • 2.1 材料和方法35-40
  • 2.1.1 材料35
  • 2.1.2 主要试剂35-36
  • 2.1.3 主要仪器与耗材36
  • 2.1.4 溶液配制36-37
  • 2.1.5 细胞培养37
  • 2.1.6 攻菌实验37
  • 2.1.7 免疫印迹37-38
  • 2.1.8 测定肿瘤坏死因子(Tnf-α)表达水平38-39
  • 2.1.9 测定激活型Caspase-3 表达39
  • 2.1.10 细胞凋亡测定39-40
  • 2.2 结果40-41
  • 2.2.1 攻菌早期细胞内磷酸化STAT1表达量测定分析(1 小时内)40
  • 2.2.2 攻菌早期细胞内促凋亡因子的表达量测定40-41
  • 2.2.3 STAT1磷酸化促进结核杆菌诱导的巨噬细胞凋亡41
  • 2.3 讨论41-42
  • 2.4 结论42-43
  • 第三章 感染后期非磷酸化STAT1抑制巨噬细胞凋亡43-60
  • 3.1 材料和方法43-49
  • 3.1.1 材料43-44
  • 3.1.2 主要试剂44
  • 3.1.3 主要仪器与耗材44
  • 3.1.4 溶液配制44-45
  • 3.1.5 细胞培养45-46
  • 3.1.6 攻菌实验46
  • 3.1.7 免疫印迹46
  • 3.1.8 CFU测定46-47
  • 3.1.9 载体构建47
  • 3.1.10 细胞转染47
  • 3.1.11 质粒稳定转染巨噬细胞系构建47
  • 3.1.12 共聚焦免疫荧光蛋白定位分析47-48
  • 3.1.13 凋亡测定48
  • 3.1.14 下游基因定量验证48-49
  • 3.1.15 细胞表面蛋白表达量分析49
  • 3.1.16 核质蛋白及线粒体蛋白分离49
  • 3.2 结果49-57
  • 3.2.1 攻菌后细胞内STAT1蛋白表达量分析49-50
  • 3.2.2 攻菌后细胞内CFU测定分析50
  • 3.2.3 慢病毒表达载体构建50-51
  • 3.2.4 稳定表达非磷酸化STAT1的巨噬细胞系构建51-52
  • 3.2.5 攻菌后非磷酸化STAT1细胞内定位变化52-53
  • 3.2.6 非磷酸化STAT1影响攻菌后巨噬细胞凋亡率及胞内活菌数53-54
  • 3.2.7 非磷酸化STAT1调控巨噬细胞下游免疫相关基因表达54-55
  • 3.2.8 非磷酸化STAT1下调巨噬细胞表面CD95表达水平55
  • 3.2.9 非磷酸化STAT1抑制CD95/CD95L通路诱导的细胞凋亡55-56
  • 3.2.10 非磷酸化STAT1不影响CD95L的表达56
  • 3.2.11 非磷酸化STAT1影响攻菌后巨噬细胞内Caspase-3 的剪切,细胞色素c的释放及Mcl-1 的表达56-57
  • 3.3 讨论57-58
  • 3.4 结论58-60
  • 第四章 非磷酸化STAT1相互作用蛋白组研究60-78
  • 4.1 材料和方法60-66
  • 4.1.1 材料60
  • 4.1.2 主要试剂60-61
  • 4.1.3 主要仪器与耗材61
  • 4.1.4 溶液配制61-62
  • 4.1.5 细胞培养62
  • 4.1.6 BL21细菌基因组DNA提取62-63
  • 4.1.7 载体构建63
  • 4.1.8 细胞转染63
  • 4.1.9 生物素化质粒稳定转染巨噬细胞系构建63-64
  • 4.1.10 免疫印迹64
  • 4.1.11 亲和纯化富集非磷酸化STAT1蛋白复合体64-65
  • 4.1.12 质谱65
  • 4.1.13 相互作用蛋白验证65-66
  • 4.1.14 非磷酸化STAT1相互作用蛋白功能注释66
  • 4.1.15 蛋白质相互作用网络构建66
  • 4.2 结果66-76
  • 4.2.1 慢病毒表达载体构建66-67
  • 4.2.2 稳定表达生物素化非磷酸化STAT1的巨噬细胞系构建67
  • 4.2.3 链亲和素介导的亲和纯化分离非磷酸化STAT1蛋白复合物67-68
  • 4.2.4 质谱鉴定非磷酸化STAT1蛋白复合物68-74
  • 4.2.5 非磷酸化STAT1相互作用蛋白验证74
  • 4.2.6 非磷酸化STAT1相互作用蛋白功能注释74-75
  • 4.2.7 非磷酸化STAT1相互作用蛋白网络75-76
  • 4.3 讨论76-77
  • 4.4 结论77-78
  • 第五章 非磷酸化STAT1与STAT3复合物通过抑制CD95表达降低结核杆菌诱导的细胞凋亡78-88
  • 5.1 材料和方法78-82
  • 5.1.1 材料78
  • 5.1.2 主要试剂78-79
  • 5.1.3 主要仪器与耗材79
  • 5.1.4 溶液配制79-80
  • 5.1.5 攻菌实验80
  • 5.1.6 RNA干扰实验80
  • 5.1.7 实时定量PCR80-81
  • 5.1.8 细胞表面蛋白表达量分析81
  • 5.1.9 凋亡测定81
  • 5.1.10 预测小鼠CD95启动子核心区域81
  • 5.1.11 染色质免疫共沉淀81-82
  • 5.2 结果82-86
  • 5.2.1 miRNA干扰STAT1,STAT3表达鉴定82-83
  • 5.2.2 攻菌后干扰STAT1,STAT3影响巨噬细胞表面CD95的表达及凋亡83-84
  • 5.2.3 小鼠CD95的启动子核心区域的鉴定84-85
  • 5.2.4 STAT1/STAT3复合体结合在CD95的启动子核心区域85-86
  • 5.3 讨论86
  • 5.4 结论86-88
  • 第六章 非磷酸化STAT1/eEF1A复合物抑制结核杆菌诱导的细胞凋亡88-96
  • 6.1 材料和方法88-92
  • 6.1.1 材料88
  • 6.1.2 主要试剂88-89
  • 6.1.3 主要仪器与耗材89
  • 6.1.4 溶液配制89-90
  • 6.1.5 攻菌实验90
  • 6.1.6 载体构建90
  • 6.1.7 细胞转染90
  • 6.1.8 蛋白免疫共沉淀90-91
  • 6.1.9 免疫印迹91-92
  • 6.2 结果92-94
  • 6.2.1 攻菌后IFIT1,eEF1A在巨噬细胞的表达升高92
  • 6.2.2 IFIT1真核表达载体构建92-93
  • 6.2.3 蛋白免疫共沉淀93
  • 6.2.4 非磷酸化STAT1竞争性结合,抑制凋亡复合物IFIT1/eEF1A的形成93-94
  • 6.3 讨论94-95
  • 6.4 结论95-96
  • 全文结论96-98
  • 参考文献98-117
  • 附录117-123
  • 致谢123-124
  • 个人简介124

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