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《西北农林科技大学》 2017年
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利用大肠杆菌构建GCRV基因工程疫苗系统研究

郝凯  
【摘要】:草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病(Grass carp hemorrhage)是严重危害草鱼的传染性疾病。但是,草鱼出血病的有效防控仍然存在挑战。疫苗免疫是预防草鱼出血病的有效途径。核酸疫苗具有制备简单、安全性高和免疫应答有效持久等优点,但是作为一种外源物质,易被组织降解、清除,导致其不能长期稳定的发挥免疫效应。在本研究中借助细菌菌蜕技术,以大肠杆菌DH5α为载体,制备了大肠杆菌菌蜕载GCRV vp7核酸疫苗,以提高核酸疫苗的免疫效果为目的,评价菌蜕介导的核酸疫苗对草鱼出血病的防控效果。细菌表面展示疫苗因其具有良好的免疫应答效果使之在疫苗开发中具有优势。本研究借助细菌表面展示技术开发了大肠杆菌表面展示GCRV VP7蛋白疫苗;进一步分别构建了大肠杆菌BL21(DE3)载嗜水气单胞菌外膜A蛋白(Outer membrane protein A,OmpA)、主要黏附素蛋白(Major adhesin,Mah)与VP7蛋白共展示疫苗,以期通过浸浴免疫达到注射免疫抗病效果,对共展示疫苗浸浴特性及其机制进行了初步研究。取得结果如下:1.通过基因重组技术构建了pCAT-lysisE/SNA/Smap29温控裂解质粒,变温诱导表达,成功制备大肠杆菌DH5α菌蜕(DH5α-BG)。溶菌动力学试验结果显示:温度诱导质粒表达4 h后,大肠杆菌的裂解效率就达到了99%。扫描电镜观察结果显示绝大部分菌体经诱导形成菌蜕,中间和两极部位出现跨膜孔道。利用菌蜕形成的跨膜孔道,采用扩散法将GCRV vp7核酸疫苗(pcDNA-vp7)装载入菌蜕内,制备了大肠杆菌DH5α菌蜕载核酸疫苗(DH5α-BG/pcDNA-vp7)。肌肉注射DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗免疫草鱼(1.8-2.0 g),结果显示:DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗可显著提高血清抗VP7蛋白特异性抗体的产生水平(P0.05),提高核酸疫苗在草鱼组织中的保留和表达时间,提高酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)活性和免疫相关基因(TNF-α、IL-1β、IgM、MHCI和IgD)的表达水平(P0.05)。免疫草鱼GCRV攻毒后,DH5α-BG/pcDNA-vp7疫苗组(5μg/尾)免疫保护率达到90%,显著高于相同剂量下纯pcDNA-vp7疫苗组(RPS=42.22%)(P0.01),上述结果表明菌蜕介导的vp7核酸疫苗能够在低剂量下实现对草鱼的免疫保护。2.通过基因重组技术构建了冰晶核蛋白N端结构域(InpN)和GCRV外衣壳蛋白vp7融合表达的pET28a-InpN/vp7质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后,Western blot检测到预期大小的目的蛋白条带,细胞组分检测发现目的蛋白定位于外层膜上,免疫荧光观察到重组菌的表面有特异性的绿色荧光信号。将大肠杆菌BL21(DE3)表面展示VP7蛋白疫苗(BL21/InpN/vp7)经腹腔注射和浸浴的方式免疫草鱼(2.7-3.0 g),结果显示:疫苗注射免疫草鱼7到21 d,血清特异性抗VP7蛋白抗体产生水平,ACP、AKP和T-AOC活性以及免疫相关基因(TNF-α、IL-1β、IgM和MHCI)的表达水平均出现显著性的上升(20-10μg VP7蛋白/尾鱼,P0.01),并且存在疫苗注射剂量依赖效应,而疫苗浸浴免疫草鱼后,并不能有效的刺激上述免疫相关指标的上升。免疫草鱼GCRV攻毒后,疫苗注射免疫最高剂量组(20μg VP7蛋白/尾鱼)免疫保护率达到88.89%,而在疫苗浸浴免疫最高浓度组(20 mg L~(-1)VP7蛋白)免疫保护率仅有18.89%。上述结果表明大肠杆菌BL21(DE3)表面展示VP7蛋白疫苗可以通过注射方式刺激草鱼产生强烈免疫应答反应,高效的保护草鱼对抗GCRV的感染。3.在pET28a-InpN/vp7质粒上分别插入了嗜水气单胞菌外膜蛋白中的外膜A蛋白基因(OmpA)和主要黏附素蛋白基因(Mah),分别构建了含有pET28a-InpN/vp7-OmpA和pET28a-InpN/vp7-Mah质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导制备了大肠杆菌BL21(DE3)表面共展示vp7-OmpA和vp7-Mah蛋白疫苗(BL21/InpN/vp7-OmpA和BL21/InpN/vp7-Mah)。将2种疫苗经浸浴免疫草鱼,结果显示:草鱼免疫7到21 d,共展示vp7-Mah蛋白疫苗(20-10 mg L~(-1 )VP7蛋白)能够显著提高血清特异性抗VP7蛋白抗体产生水平(P0.01),显著提高ACP、AKP和T-AOC活性以及免疫相关基因(TNF-α、IL-1β、IgM和MHCI)的表达水平(P0.01),并且存在疫苗浓度依赖效应;而共展示vp7-OmpA蛋白疫苗并不能有效的刺激上述免疫相关指标的上升。将2种疫苗经注射免疫草鱼,结果显示:草鱼免疫7到21 d,2种疫苗(20-10μg VP7蛋白/尾鱼)均能够显著诱导上述免疫相关指标的上升(P0.01)。免疫草鱼GCRV攻毒结果显示:在20 mg L~(-1 )VP7蛋白浓度下,表面共展示vp7-Mah蛋白疫苗浸浴免疫保护率达到51.11%,而表面共展示vp7-OmpA蛋白疫苗浸浴免疫保护率仅有20%。表面共展示vp7-OmpA和vp7-Mah蛋白疫苗注射免疫保护率分别达到82.22%和91.11%(20μg VP7蛋白/尾鱼)。上述结果表明在大肠杆菌表面展示VP7蛋白疫苗上锚定Mah蛋白后,疫苗能经浸浴方式刺激草鱼产生强烈免疫应答反应,有效的保护草鱼对抗GCRV的感染。4.以鲤上皮瘤细胞(EPC)为模型,采用细胞裂解计数法研究了BL21/InpN/vp7-Mah对EPC细胞的粘附和侵染性,我们发现Mah蛋白的表面展示能够显著提高大肠杆菌的粘附和侵染能力。囊泡介导的胞吞在BL21/InpN/vp7-Mah内化过程发挥主要作用。通过荧光显像和流式细胞术研究了BL21/InpN/vp7-Mah内化与微丝变化的关系,结果发现BL21/InpN/vp7-Mah内化过程可以引起细胞内微丝的重排以及聚合组装。微丝聚合抑制剂预处理细胞能够明显抑制BL21/InpN/vp7-Mah的内化,这些结果表明BL21/InpN/vp7-Mah的内化过程依赖微丝的重排和聚合。利用Western blot技术研究了BL21/InpN/vp7-Mah内化过程对具有微丝调控功能的p38-HSP27通路中p38激酶和HSP27磷酸化的影响,结果发现BL21/InpN/vp7-Mah内化过程能够明显促进p38激酶和HSP27发生磷酸化。之后,使用p38激酶抑制剂预处理细胞后,BL21/InpN/vp7-Mah的内化受到抑制,这些结果表明具有调控微丝功能的p38-HSP27通路的激活在BL21/InpN/vp7-Mah侵染EPC细胞过程中起到了一定作用。综上所示,菌蜕作为GCRV vp7核酸疫苗递送载体可以提高核酸疫苗在草鱼组织中的保留和表达时间,提高草鱼特异性抗体的产生水平和免疫应答水平,实现草鱼高效免疫保护。大肠杆菌BL21(DE3)表面展示VP7蛋白疫苗能通过注射方式实现对草鱼的高效免疫保护。进一步,利用表面展示技术锚定Mah蛋白后,大肠杆菌BL21(DE3)表面共展示vp7-Mah蛋白疫苗经浸浴方式提高了对草鱼的免疫保护,有效抵抗GCRV感染,这可能与Mah蛋白能够提高大肠杆菌BL21(DE3)的侵袭力有关。以上研究结果为预防草鱼出血病疫苗的开发提供了参考资料和新的思路。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S948

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