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《西北农林科技大学》 2017年
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解旋酶DHX36解旋G-四链体结构机理研究

陈伟飞  
【摘要】:解旋酶是一类广泛存在于病毒、细菌以及真核细胞内的蛋白分子马达,同时参与DNA的复制、重组、修复、转录、翻译和RNA剪接等多种生命活动。DNA修复过程相关解旋酶的突变可能导致多种人类疾病如基因组不稳定性、免疫缺陷、智力迟钝、过早衰老和易患癌症等。DHX36解旋酶(又称RHAU,G4R1)属于RNA解旋酶的DEAH盒家族。DHX36是作为HeLa细胞裂解物中富含AU元件(ARE)的尿激酶纤溶酶原激活mRNA相关蛋白质复合物的一部分被发现的。研究表明,DHX36参与如造血作用、心脏发育、精原细胞分化和神经元前体微RNA的树突状定位等多种不同的生物过程。此外,浆细胞样树突状细胞(pDC)中的DHX36通过DEAH盒基序特异性识别和结合富含G的DNA(CpG-A),以引发相关细胞因子应答,因此DHX36也参与抗病毒免疫。同时DHX36还被认为是HeLa细胞裂解物中G-四链体(简称G4)解旋活性的主要来源。已有大量的体外实验数据证实了DHX36也具有解旋G4结构的活性。DHX36由负责ATP结合、水解和解旋的核心结构域,和其两侧N端、C端的延伸结构组成。虽然C末端结构域的生物学功能是未知的,但是已有证据表明N末端结构域可以特异性地结合G4结构。由于缺乏原子水平的三维结构信息,DHX36解旋酶的分子作用机制目前仍不清楚。本论文应用如分子排阻色谱,动态激光散射(DLS),基于荧光各向异性的分子亲和力检测技术,基于荧光共振原理快速停留技术,基于荧光共振原理单分子操作技术,X射线单晶衍射技术和X射线生物小角散射技术等多种生物化学和生物物理学手段,针对果蝇DHX36(DmDHX36)进行研究并得到以下主要成果:首先,我们首次得到了高分辨的DmDHX36与DNA和RNA复合体的晶体结构,从而阐释了DmDHX36识别DNA和RNA底物的分子基础。其次,得到DmDHX36与不同结构、序列DNA的复合体结构,通过深入分析结合其他生化手段,我们首次提出DmDHX36对富含G的DNA序列具有极强的偏好性,这种偏好性不仅表现为对富含G的DNA序列的极强的亲和性上,还表现在解旋DNA双链和在DNA单链上移动活性的强弱上。对富含G的DNA序列的极强的亲和性可能是DHX36参与固有免疫反应的主要原因。再次,通过Dm DHX36-RNA复合物与MLE-RNA-ADPAlF4复合物和Prp43p-ADP复合物的比较,我们首次提出DmDHX36在单链核酸上移动的分子模型。最后,通过生物小角衍射和单分子技术结合上述结构基础,我们首次提出了一种全新的G4结构解旋模型,即两步解旋模型(主动-被动模型)。第一步,DmDHX36通过N端特异序列和正电口袋识别、结合G4结构,此步中G4会变得不稳定。第二步,DmDHX36通过结合和水解ATP彻底打开G4结构,由于DmDHX36对G的偏好性,当富含G的序列进入到DmDHX36内部时,整个反应会被加强。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q75

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