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《西北农林科技大学》 2017年
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猪NANOG基因的特性及其上下游调控网络的研究

杨藩  
【摘要】:猪多能干细胞包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)在农业生产和器官移植方面都具有巨大的潜在效益。由于尚未能从猪胚胎中分离得到猪ESCs,采用Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四因子导入猪成纤维细胞,诱导获得iPSCs已经成为研究猪ESCs的最好替代手段。目前,国内外已经有很多实验室通过导入外源多能基因获得了猪iPSCs。本研究将以猪i PS细胞为材料,研究猪NANOG基因的结构和功能特性及其上游Activin/Nodal通路和下游靶基因ESRRB在猪iPSCs多能性维持和细胞重编程过程中的分子机制。实验结果如下:1.猪NANOG基因的结构和功能Nanog含有homeodomian结构域,在维持人和小鼠ESCs中起着重要作用。通过对基因组序列进行对比发现,猪NANOG是由1号染色体编码的单外显子基因,存在两个假基因NANOGP1和NANOGP2。NANOGP1位于第5号染色体,含有类似于人和小鼠Nanog的外显子和内含子结构,但缺乏homeodomain结构域。NANOGP2具有和NANOG相似的核酸序列,但由于碱基缺失导致移码突变,不能编码有功能的蛋白。RNA-seq数据分析发现NANOG不是由NANOGP1和NANOGP2编码。NANOG蛋白含有N,H和C1/W/C2结构域,其中H(homeodomain)结构域对NANOG蛋白入核是必须的,C1/W/C2结构域具有基因调控功能。在猪胎儿成纤维细胞(PEF)中过表达NANOG可以上调相关多能基因的表达。上述结果表明,猪NANOG具有与小鼠和人不同的基因结构;猪NANOG可以被OCT4/SOX2调控,并且它可以激活其下游的多能基因的表达。2.猪ESRRB基因可以促进体细胞重编程Esrrb(estrogen-related receptor b)是孤儿核受体(orphan nuclear receptor),能够调控与自我更新和多能性相关的基因表达。本研究首先揭示了ESRRB在猪iPS和胚胎中的表达模式。通过在传统的四个转录因子Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc中加入猪ESRRB(OSKM+E),该组合可以明显提高体细胞重编程效率。重编程的i PS细胞表现出AP阳性,高表达OCT4,SOX2,SALL4等多能性相关基因。进一步分析发现,多能基因OCT4,SALL4,NANOG均含有ESRRB的结合位点。过表达ESRRB可以明显上调OCT4和SALL4的表达,但是对NANOG无明显影响。另一方面,通过shRNA干扰ESRRB表达,会导致多能基因的下调和iPS细胞的分化。上述结果揭示,ESRRB可以通过调控OCT4和SALL4基因表达,维持猪干细胞的多能状态,并可以促进体细胞重编程。3.猪ESRRB及其相关基因的分子生物学分析雌激素相关受体基因(ESRR)在组织发育和多能性维持中发挥重要作用。ESRR的剪切体、基因结构和功能已经在人和小鼠上有研究。但是,大家畜的相关研究很少。本研究克隆了猪ESRR家族的相关基因:ESRRA,ESRRB和ESRRG。同时,发现了两个ESRRA的可变剪切体ESRRA1和ESRRA2,及一个全新的ESRRG序列。通过研究ESRR不同结构域对雌激素应答原件的影响,发现C结构域对于ESRR家族的转录调控很重要,能够与配体结合的E结构域转录激活作用不明显。4.Activin-SMAD通路调控NANOG及其他多能因子的表达猪iPS细胞存在三种多能状态,即依赖bFGF的primed状态;依赖LIF的niave状态和依赖LIF/b FGF的metastable状态。通过对猪iPS不同状态的基因表达谱分析发现,Activin-SMAD信号通路在重编程的iPS细胞中均被激活。在培养液中添加Activin A或超表达SAMD2/3可以显著提高NANOG以及其他多能因子的表达。相反,通过添加SB431512抑制剂或者超表达SMAD7,抑制Activin-SMAD通路,可以显著降低NANOG以及其他多能因子的表达,并导致iPSCs分化。实验数据表明,添加Activin A维持Activin-SMAD通路活性有助于维持猪多能干细胞的体外生长。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S828;Q78

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