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《西北农林科技大学》 2017年
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丹参SmSnRK2s基因和SmAREB1基因的克隆及功能分析

贾彦彦  
【摘要】:丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统大宗药材之一,具有广泛的药理作用。当前,丹参的野生资源已远远不能满足对丹参日益增加的需求量。丹参水溶性成分丹酚酸作为丹参的主要有效成分之一,由于其显著的药用疗效以及中国传统中药是以水煎服的形式服用,利用基因工程手段提高其含量已经成为当前研究的热点。水溶性酚酸类成分也属于次生代谢物质,其合成和积累受外界环境胁迫的影响,然而,丹参的抗逆基因工程研究仍然处于起步阶段,从丹参中克隆出来的参与逆境胁迫的基因很少。既能促进丹参酚酸类物质的积累,又可以参与丹参抵御胁迫能力提升的基因的挖掘和筛选是当前我们需要努力的方向。研究报道称,蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(SnRK2s)家族成员在ABA和非生物胁迫信号转导中起着重要的枢纽作用,并且还可以参与碳代谢的调控。因此,本研究基于丹参转录组数据库,从丹参毛状根中克隆了3个SnRK2s家族成员基因:SmSnRK2.3,SmSnRK2.4和SmSnRK2.6,以及1个AREB/ABFs转录因子基因:SmAREB1,将受外源ABA强烈诱导的SmSnRK2.3、SmSnRK2.6和SmAREB1进行了重点分析,探讨了这三个基因对丹参酚酸类物质合成的影响,并验证了SmSnRK2.3和SmSnRK2.6蛋白激酶与SmAREB1转录因子的互作关系。主要研究内容和结果如下:1.以丹参毛状根为实验材料,利用反转录PCR克隆了SmSnRK2.3、SmSnRK2.4、SmSnRK2.6和SmAREB1基因。分析测序结果显示,4条目的基因分别包含一个1,068 bp、1,068 bp、1,098 bp和1,272 bp的开放阅读框,分别编码355、355、365和423个氨基酸,预测的蛋白质分子量分别为:40.327 kDa、40.63 kDa、41.340 kDa和45.467 kDa。结合它们的DNA序列,利用GSDS2.0在线软件分析结果显示:SmSnRK2.3含有7个内含子和8个外显子;SmSnRK2.4和SmSnRK2.6含有8个内含子和9个外显子;SmAREB1含有3个内含子和4个外显子。系统进化分析显示,SmSnRK2.4属于第I亚类SnRK2s蛋白激酶;SmSnRK2.3和SmSnRK2.6属于第III亚类SnRK2s蛋白激酶;SmAREB1与拟南芥中被ABA和渗透胁迫显著诱导的AtAREB1、AtAREB2和AtABF3聚类在同一分支上。2.基于丹参基因组数据库,分别获得了2,048 bp、3,000 bp、1,865 bp和1,911 bp的SmSnRK2.3、SmSnRK2.4、SmSnRK2.6和SmAREB1基因的5’侧翼序列。PlantCARE data分析显示,这4个目的基因的启动子序列中除了基本的保守顺式作用元件TATA box和CAAT box外,均含有激素相关、非生物胁迫相关以及生长发育相关的顺式作用元件。推测它们均参与非生物胁迫和激素响应过程,以及参与植物的生长发育调控过程。3.利用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测了4个基因在丹参幼苗的根、茎和叶中的表达水平,结果表明4个目的基因在所有检测部位中均有表达。SmSnRK2.3在根、茎和叶中的表达量差异不大;SmSnRK2.4在根中的表达量最高,在茎中和叶中的表达量几乎相同;SmSnRK2.6和SmAREB1在叶中的表达量显著高于其在根和茎中的表达量,而在根和茎中的表达量几乎相同。此外,利用qRT-PCR也检测了这4个目的基因对外源ABA处理的响应情况,结果显示,SmSnRK2.4对外源ABA处理响应微弱,SmSnRK2.3、SmSnRK2.6和SmAREB1强烈响应外源ABA。4.研究了这4个目的基因的原核表达。通过构建目的基因的原核表达载体,将重组质粒转化到原核表达菌株E.coli Rosetta中,并利用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳显示,这4个目的基因均诱导出和预测蛋白大小一致的蛋白条带。利用细胞超声破碎仪分别对诱导后的SmSnRK2.3、SmSnRK2.6和SmAREB1蛋白菌体进行破碎,分析了它们的可溶性存在情况,并利用Western blot验证了纯化出的目的蛋白的纯度和分子量大小。此外,本试验中,我们利用高效液相串联质谱鉴定出SmSnRK2.3的3个和SmSnRK2.6的14个非冗余的磷酸化位点。5.构建了SmSnRK2.3、SmSnRK2.6和SmAREB1基因的亚细胞定位分析载体。利用烟草瞬时表达分析体系,观察到SmSnRK2.3和SmSnRK2.6蛋白定位在烟草表皮细胞的细胞膜、细胞质和细胞核;利用基因枪轰击洋葱表皮细胞法,观察到SmAREB1蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞核。6.构建了SmSnRK2.3、SmSnRK2.6和SmAREB1基因的过表达载体,并通过发根农杆菌ATCC15834介导的毛状根转化体系获得了对应基因的过表达转基因毛状根株系:SmSnRK2.3-OEs、SmSnRK2.6-OEs和SmAREB1-OEs。以仅转化空载体的毛状根株系(EVs)作为对照,利用高效液相色谱法分别分析了过表达转基因毛状根中酚酸类物质的含量,结果发现,过表达SmSnRK2.6和SmAREB1显著促进了丹参转基因毛状根中丹酚酸B(SalB)和迷迭香酸(RA)的含量,而过表达SmSnRK2.3并未显著促进SalB和RA的含量。进一步的qRT-PCR分析表明,过表达SmSnRK2.6和SmAREB1促进代谢流流向迷迭香酸合成途径,提高迷迭香酸合成途径中关键酶基因的表达。7.SmAREB1的转录激活活性分析显示,SmAREB1在酵母AH109中没有激活活性。酵母双杂交和双分子荧光互补实验分析发现,SmSnRK2.3和SmSnRK2.6与SmAREB1存在物理互作。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S567.53

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