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《西北农林科技大学》 2018年
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枯草芽孢杆菌芽孢孢壳突变株的构建及其对猪肺泡巨噬细胞(Mφ3D4/2)的免疫调控作用

吕妍  
【摘要】:益生菌可调节动物肠道健康,已广泛应用于畜牧生产中,其中,枯草芽孢杆菌是应用最广泛的益生菌之一。枯草芽孢杆菌在体外以营养体或芽孢形式均可发挥免疫调节功能,但在体内环境下,芽孢更能适应胃肠道环境,并担任免疫职责,然而其免疫调节机制仍不清楚。鉴于此,研究枯草芽孢杆菌芽孢具有怎样的免疫调节功能,探究其调节免疫的途径,将为枯草芽孢杆菌免疫功能的开发及健康养殖提供科学依据。本试验旨在研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)芽孢孢壳突变株对猪肺泡巨噬细胞(Mφ3D4/2)的免疫调节功能。试验包括三部分:(1)利用双交叉同源重组方法,从B.subtilis野生菌株1A747基因组DNA中分别敲除B.subtilis芽孢孢壳基底层关键基因spoIVA、内壳层关键基因safA、外壳层关键基因cotE、表皮层关键基因cotX、cotZ和cgeA,获得B.subtilis spoIVA~-、B.subtilis safA~-、B.subtilis cotE~-、B.subtilis cotX~-、B.subtilis cotZ~-、B.subtilis cgeA~-六个B.subtilis芽孢孢壳突变株;(2)检测突变株的生长能力、生孢及萌发性能,并利用透射电镜观察突变株孢壳形态结构的变化;(3)以PBS、脂多糖(LPS)、B.subtilis 1A747芽孢为对照组,B.subtilis safA~-、B.subtilis cotE~-、B.subtilis cotX~-、B.subtilis cotZ~-、B.subtilis cgeA~-五个突变株芽孢为试验组,分别与Mφ3D4/2细胞共培养12 h,收集培养液上清用于ELISA检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α的浓度,收集细胞用于qRT-PCR检测TLR2、TLR4、TLR9及依赖MyD88信号途径关键基因蛋白髓样分化因子(MyD88)、白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)、核因子κ轻链多肽B细胞增强因子2(NF-κB2)转录水平变化。研究结果如下:1.PCR及测序结果显示,成功敲除了B.subtilis1A747的芽孢孢壳蛋白关键基因spoIVA、safA、cotE、cotX、cotZ、cgeA,获得六株孢壳蛋白突变株。2.生长性能检测结果显示,B.subtilis spoIVA~-的生长能力与野生菌1A747相比明显降低,其生孢能力严重受损,显微镜下很难观察到完整结构的芽孢,无法进行后续试验,其余突变株生长性能正常。经透射电镜观察芽孢孢壳结构发现:B.subtilis spoIVA~-芽孢结构混乱;B.subtilis safA~-的芽孢内壳层结构变薄且模糊;B.subtilis cotE~-芽孢无明显的外壳层结构。3.B.subtili-s cotX~-、B.subtilis cgeA~-、B.subtilis cotZ~-、B.subtilis saf A~-、B.subtilis cotE~-的芽孢均可以显著引起TLR4 mRNA水平的升高(P0.05);与TLR结合后,突变株B.subtilis cotX~-可以促进MyD88、IRAK1、NF-κB2的转录(P0.05),并显著提高了促炎性因子IL-1β及IL-8的表达(P0.05);B.subtilis cotE~-可以显著引起MyD88与NF-κB2的mRNA水平升高(P0.05),并且提高了IL-8与TNF-α的表达(P0.05);B.subtilis cgeA~-可以显著提高NF-κB2的转录水平及四种促炎性因子的表达(P0.05);B.subtilis safA~-对IRAK1的转录有促进作用(P0.05),在其作用下,炎性因子IL-1β、IL-8及TNF-α的表达也得到提高(P0.05);B.subtilis cotZ~-可以显著提高促炎因子IL-1β、IL-8及TNF-α的表达而不激活MyD88(P0.05)。研究结论:枯草芽孢杆菌野生菌芽孢及孢壳突变株均可不同程度地刺激Mφ3D4/2细胞产生免疫应答,这也说明孢壳蛋白在芽孢的免疫调控功能中发挥了关键作用。而依赖MyD88信号通路很有可能是突变株B.subtilis cot X~-与B.subtilis cotE~-发挥免疫刺激功能的信号传导途径之一,是否有别的通路参与调控有待进一步探究。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S816.3

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