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《西北农林科技大学》 2018年
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禽4型腺病毒(FAdV-4)亚单位疫苗的研究

唐秋霞  
【摘要】:禽4型腺病毒(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)对鸡具有较强的致病性,特别是对3至5周龄的肉鸡,可导致30-80%死亡率,它已成为近30年来导致家禽行业经济损失的主要原因之一。肝脏组织是FAdV-4感染的主要靶器官,而感染病毒的鸡通常表现为心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS),典型症状为心包中有清澈的、淡黄色的液体聚集,并伴有肝炎和肾炎。FAd V-4有很强的感染性,可以水平传播,也可以垂直传播。FAdV-4可以从受感染的肝匀浆中分离出来,并可通过几种实验室诊断方法检测(琼脂凝胶扩散试验,间接免疫荧光试验,ELISA,限制性酶切和PCR)。尽管组织灭活疫苗已经应用于控制这种疾病,但新型疫苗可能能够更好的防控FAdV-4造成的疫病,本文研究了FAdV-4的不同来源的亚单位疫苗,研究结果如下。1.FAdV-4的分离与鉴定2015年10月采集陕西省大荔县某肉鸡养殖场HPS疑似病料经匀浆处理,接种鸡胚、CEF细胞、LMH细胞对病原分离培养,经PCR、间接免疫荧光、透射电子显微镜和动物回归试验对病原体进行鉴定。结果显示可用LMH细胞成功分离病毒,PCR可以扩增出特异条带,测序结果证明分离病毒为FAdV-4,与JSJ13和ON1位于同一分支,属于FAdV-C。用分离病毒进行攻毒试验,攻毒组雏鸡死亡率为80%,病理变化与临床HPS相似,心包有严重的清澈的、淡黄色的心包积液,肝脏肿大、变黄棕色和有出血性坏死灶,肾脏充血、肿大和有尿酸盐沉积。本研究成功分离到一株FAdV-4,命名为FAdV-4/Chicken/Shaanxi/China/2015。2.Hexon loop1、penton base、fiber-1和fiber-2重组蛋白免疫效果评价原核表达FAdV-4的4衣壳蛋白fiber-1、fiber-2、penton base和hexon loop-1,纯化后与佐剂1:1乳化,对雏鸡进行不同剂量免疫,并评价攻毒后的免疫保护力。结果显示,fiber-2诱导了最佳的免疫保护,其次是fiber-1、hexon和penton。当免疫剂量为50μg时,fiber-2可为10~(5.5) TCID_(50)的病毒攻毒提供完全保护;fiber-1、hexon和penton的免疫效果是剂量依赖性的,当免疫剂量增加到200μg时,可诱导完全的免疫保护。3.FAdV-4病毒样颗粒(virus like particles,VLP)的包装鉴定及免疫效力评价包装可以表达fiber-1、fiber-2和penton base的重组腺病毒rh Ad-fiber-1、rhAd-fiber-2和rhAd-penton base,经western blot和IFA验证后,将3种腺病毒同时转导293T细胞,收集细胞裂解液,用电子显微镜观察重组fiber-1、fiber-2和penton base是否可以自我组装成病毒样颗粒(VLP),并将获得的VLP样品接种细胞,检测VLP是否可以转导进细胞。结果显示,用3种重组病毒转导293T细胞时,可以生成VLP,且VLP可以在迅速在细胞周围聚集,并进入细胞。本研究首次证明了FAdV-4衣壳蛋白fiber-1、fiber-2、penton base可以形成VLP,且可以转导细胞,是一种优良疫苗候选分子,可被用于FAdV-4的防控。用FAdV-4 VLP、rhAd-fiber-1、rhAd-fiber-2、rhAd-penton base和灭活的FAdV-4疫苗免疫鸡后,进行攻毒实验,以检测几种疫苗候选分子的免疫作用,根据体液免疫应答、细胞免疫应答、死亡率和组织大体/微观病变结果评估疫苗免疫效果。结果显示FAdV-4VLP诱导了最高水平的IFN-γ、IL-4和MHC-Ⅱ表达,体液免疫应答也显著高于对照组;FAdV-4 VLP和rhAd-fiber-2诱导了100%的攻毒保护力。本次研究证明FAdV-4 VLP和rhAd-fiber-2是好的FAdV-4疫苗候选分子,可用FAd V-4的防控。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.65

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