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《西北农林科技大学》 2019年
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鸡MDA5调控新城疫病毒免疫反应机制研究

韩青松  
【摘要】:新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease virus,NDV)强毒株引起的家禽急性高度接触性传染病,临床症状主要以体温升高、下痢、神经损伤、呼吸障碍、消化道和呼吸道的出血为特征。NDV可以感染包括家禽在内的至少240种鸟类和一些哺乳动物。该病在世界范围内广泛流行,给养禽业带来了巨大的经济损失。我国采取了积极免疫的措施进行ND的防控,已经控制了ND在我国大范围的流行,但由于我国养殖场生物安全体系差、NDV免疫失败等原因,ND的局部暴发时有发生。因此迫切需要探索新的ND防控策略。鸡MDA5(Chicken Melanoma Differentiation Association antigen 5,chMDA5)是鸡体细胞内监测外源病毒感染的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRR)之一,能够识别NDV感染,并介导干扰素(Interferon,IFN)的表达,启动鸡体的抗病毒天然免疫反应。探究chMDA5对NDV感染和宿主免疫反应的调控,有助于从机体角度阐明抗病毒和增强疫苗免疫力的机制,为揭示病毒和机体之间的相互作用提供新的资料,为提高NDV疫苗免疫效果提供新的参考。本课题主要研究内容和结果如下:1.chMDA5在体外诱导干扰素表达的研究NDV强毒株F48E9和弱毒株La Sota以0.1 MOI感染DF-1细胞,在感染后8 h、12 h、24 h和48 h用RT-qPCR方法检测chMDA5和IFN-β表达发现,F48E9和La Sota感染DF-1细胞都能引起chMDA5表达的上调,F48E9感染DF-1细胞诱导IFN-β表达上调,而La Sota感染DF-1细胞只有在感染后24 h时诱导IFN-β表达上调。将F48E9和La Sota以10~5PFU/只感染SPF鸡,用RT-qPCR方法检测chMDA5和IFN-β表达发现,F48E9和La Sota感染鸡体后均能诱导鸡体肺脏chMDA5和FN-β表达上调;F48E9感染鸡体后诱导鸡体脾脏chMDA5表达上调,诱导IFN-β表达先下调后上调再达到正常水平;La Sota感染鸡体后,12 h鸡体脾脏chMDA5表达下调,24 h和48 h后chMDA5表达上调,抑制鸡体脾脏IFN-β表达。应用带有chMDA5的真核表达质粒在DF-1上过表达chMDA5发现,在体外过表达chDMA5能够显著诱导细胞IFN-β表达,并抑制NDV强毒株F48E9的增殖。应用RNA干扰技术抑制DF-1细胞chMDA5表达发现,抑制细胞中chMDA5表达能够显著抑制细胞IFN-β表达,但对NDVF48E9的增殖无显著影响。2.诱导干扰素表达的chMDA5功能域研究chMDA5由1001个氨基酸残基组成。为了探究其诱导干扰素表达的功能域,根据chMDA5结构将其分为1~328 aa、1~483 aa、1~642 aa、325~1001 aa和全长等5个不同长度的片段,并以pCMV-3HA为骨架构建了5个表达这些chMDA5不同片段的真核表达载体。转染DF-1细胞,Western blot检测发现5个片段均能在DF-1细胞中得到表达。用RT-qPCR方法检测IFN-β表达,发现能诱导鸡IFN-β表达的片段都含有半胱氨酸蛋白酶激活和募集结构域(Caspase activation and recruitment domain,CARD)。1~483 aa和1~642 aa诱导IFN-β表达水平差异不显著,且和全长chMDA5诱导IFN-β表达水平差异不显著。因此,chMDA5的1~483 aa可以作为研究chMDA5诱导IFN-β表达的功能域。3.chMDA5影响NDV对鸡致病性的研究构建并获得了能够表达chMDA5前483 aa的重组腺病毒rAd-MDA5和干扰chMDA5表达的重组腺病毒rAd-shM5。rAd-MDA5感染DF-1细胞后能够介导chMDA5(483 aa)的表达并诱导鸡IFN-β的表达;rAd-shM5感染DF-1细胞后能够显著降低chMDA5和IFN-β的表达,且下调F48E9感染细胞诱导的chMDA5和IFN-β的表达。rAd-MDA5注射鸡体后能够上调宿主chMDA5表达。与单独F48E9感染相比,共感染rAd-MDA5和F48E9能够显著上调F48E9攻毒后鸡体肺脏IFN-β的表达水平,降低肺脏病毒载量,并延长攻毒后鸡群的存活时间。而rAd-shM5注射鸡体后能够在鸡体内抑制chMDA5和IFN-β表达,但对F48E9感染后鸡群的存活时间无显著影响。4.chMDA5辅助激活适应性免疫反应的研究将表达chMDA5(483 aa)的重组腺病毒rAd-MDA5和NDV灭活疫苗共同免疫SPF鸡。免疫后每7天采集血液,用血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)方法检测血清抗体水平发现,腺病毒rAd-MDA5表达的chMDA5(483 aa)增强了NDV灭活疫苗诱导的体液免疫。在二免24 h后,采集鸡体脾脏,用RT-qPCR检测IL-4、IFN-γ和MHC-Ⅱ的表达,发现chMDA5(483 aa)增强了鸡体这些细胞免疫相关因子的表达。在鸡体攻毒前采集鸡体外周血,淋巴细胞增殖实验结果表明,chMDA5(483 aa)提高了联合免疫rAd-MDA5和NDV灭活疫苗鸡体的淋巴细胞刺激指数。将鸡体以10~4TCID_(50)/只的剂量感染NDV强毒株F48E9发现,联合免疫rAd-MDA5和NDV灭活疫苗,降低了感染引起的发病率、组织损伤、器官病毒载量和排毒。这些结果表明,chMDA(483 aa)增强了NDV灭活疫苗的免疫效果。综上所述,本研究详细阐述了NDV感染细胞和鸡体后chMDA5和IFN-β的表达规律,研究了chMDA5诱导IFN表达的功能域,阐明了chMDA5对NDV增殖及其对鸡致病性的影响,揭示了chMDA5(483 aa)增强NDV灭活疫苗免疫效果的机制。一方面为进一步研究chMDA5功能提供理论基础,为进一步研究chMDA5帮助宿主抵抗NDV的感染提供依据;另一方面为增强NDV疫苗免疫效果提供了新的方法,也为ND新型疫苗开发提供了候选佐剂。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S852.4

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