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《西北农林科技大学》 2019年
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伪结核棒状杆菌的分离鉴定和传代致弱及类毒素的免疫应用

王斌  
【摘要】:伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberulosis,C.p)是一种人畜共患病原菌,在养殖业中能对多种动物感染,其中以羊的感染最为多见,能够引起羊干酪性淋巴结炎(Caseous lymphadenitis,CLA),在国内外均有其流行报道。羊群感染伪结核棒状杆菌后,常不致死,多呈慢性经过,病羊表现为渐近性消瘦、被毛粗乱、局部干酪样脓肿病变等症状,除影响皮毛、肉制品、乳制品质量和降低其经济价值外,还能够威胁公共卫生安全,已经对世界养羊业发展造成较大损失。近年来,在我国畜牧业快速发展的同时,羊干酪性淋巴结炎也在我国多省份出现流行,其中山羊发病报道多于绵羊,且有更加严重的流行趋势。羊干酪性淋巴结炎发病数量逐渐增多,但目前对该病原及防控方法研究较少。本研究在陕西宝鸡和铜川两地的关中奶山羊养殖场中,采集干酪性淋巴结炎发病羊脓肿组织病料,通过细菌分离培养方法获得疑似伪结核棒状杆菌菌株两株,对其进行了挑纯、染色镜检、生化试验、分子生物学鉴定和动物致病性试验;对分离鉴定的两株伪结核棒状杆菌LX1和TC11菌株进行体外连续传代培养,用两株细菌的原代、50代、100代、150代和200代菌株分别进行小鼠致病性试验,同时使用致弱效果较好菌株的200代菌株注射小鼠14 d后,用致病性较强的原代菌株进行攻菌试验,以研究传代致弱方法对开发弱毒疫苗的可行性;为开发类毒素疫苗,将表达的毒素磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)用5%的甲醛(V/V),室温作用48 h进行灭活制成类毒素制剂,分别免疫小鼠和两批山羊,用间接ELISA测免疫后30 d、90 d和150 d山羊血清抗体。试验结果如下:1.分离菌株LX1和TC11经37℃培养48 h后,在麦康凯琼脂培养基不生长,在营养琼脂培养基生长贫瘠,鲜血琼脂培养基上可见乳白色、干燥、易于刮落、不透明、边缘较整齐,直径约1 mm~2 mm的菌落。革兰氏染色阳性,呈球状、球杆状或棒状,生化试验和16S rRNA的PCR鉴定结果确定分离菌株为伪结核棒状杆菌,且两株分离菌株均能使小鼠死亡或注射部位引发干酪样脓肿病变;药敏试验结果表明,两菌株对磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内脂类等抗生素均敏感,多粘菌素均耐药。2.LX1和TC11菌株的原代与第50、100、150和200代菌株接种小鼠后7 d内,LX1原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠注射部位脓肿病变区域平均直径为8.7mm,传代菌株注射小鼠均未死亡,病变平均直径分别为4.6 mm、2.6 mm、1.4 mm和1 mm;TC11原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠平均病变直径为9.3 mm,传代菌株注射小鼠均未死亡,病变平均直径分别为5.4 mm、2.8 mm、1.8 mm和1.4 mm。LX1第200代菌株接种小鼠14 d后攻菌,10只实验组小鼠无死亡个体,平均脓肿直径为2.0 mm,10只对照组小鼠死亡4只,未死亡小鼠平均脓肿直径为7.8 mm;3.类毒素免疫试验中,攻菌7 d内,试验组小鼠10只均未死亡,1只小鼠发病,保护率为90%(9/10),对照组小鼠死亡4只,剩余6只全部发病;羊群预实验中,90 d内实验组干酪性淋巴结炎发病1头,病原为金黄色葡萄球菌;对照组发生干酪性淋巴结炎3头,分离到伪结核棒状杆菌两株;羊群大规模免疫试验中,150 d内实验组干酪性淋巴结炎发病羊为8头,分离到1株伪结核棒状杆菌,伪结核棒状杆菌感染率为0.9%(1/114),对照组干酪性淋巴结炎发病羊23头,分离到9株伪结核棒状杆菌,伪结核棒状杆菌感染率为7.9%(9/114);免疫羊血清OD_(450)检测结果表明,在免疫后30 d内抗体水平最高,而后呈下降趋势,在150 d时接近阳性血清临界值。以上研究结果证实,连续传代的方法可有将伪结核棒状杆菌毒力致弱,为伪结核棒状杆菌弱毒疫苗开发奠定理论基础;羊伪结核棒状杆菌类毒素疫苗能够为免疫小鼠和免疫羊只提供一定的免疫保护,但存在免疫有效期短的问题,需要后期研究延长免疫有效期。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S852.61

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